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PUMA基因BS1、BS2位点突变和启动子区甲基化与肺癌的相关性研究

作　者: 郭晓静
导　师: 王玉明；段勇
学　校: 昆明医学院
专　业: 检验诊断学
关键词: PUMA MSRE MRDE 甲基化肺癌
分类号: R734.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的1.探讨肺癌组织中PUMA (p53 up-regulated modulator of apoptosis)基因启动子的p53结合位点BS1、BS2是否存在变异情况。2.探讨PUMA基因启动子区CpG岛甲基化水平与肺癌及其病理分型之间的相关性。方法1.通过对实验条件的探讨,优化并确立了PUMA与p53结合的BS1、BS2位点(GC含量76.3％)PCR扩增的最适实验条件,并对43例肺癌组织BS1、BS2位点DNA片段进行PCR扩增,扩增产物经纯化后测序检测有无碱基变异。2.应用METHYLSCREEN方法,使用甲基化敏感酶(MSRE)和甲基化依赖酶(MDRE)对样本进行酶切,酶切产物用实时荧光定量分析方法检测35例肺癌组织和10例肺良性病变组织中的PUMA基因启动子区CpG岛甲基化的相对比值(即Hypermethylation, Unmethylation, Intermediamethylation的百分比)。结果1.PUMA与p53结合的BSl、BS2位点DNA片段PCR反应体系为dNTP 250μtmol/LMgCl2 1.5mmol/L,上下游引物各250nmol/L,TaqDNA聚合酶(High GC 2U/μL)0.04U/μl,模板量2000ng,5×Buffer 10μL,总体积50μl。反应条件为95℃预变性5min,95℃1min,65℃1min,72℃1min,循环33次,最后72℃延伸5min。43例样本均扩增成功,经测序分析未检出碱基变异。2. PUMA启动子甲基化的酶切体系为：DNA模板250ng加入26μl酶切缓冲液,补无核酸酶水至总体积120μl。通过加入甲基化敏感限制性内切酶或/和甲基化依赖限制性内切酶组成Mo、Ms、Md、Msd 4个酶切反应。其中Mo不加酶,Ms加MSRE1μl, Md加MDRE1μl, Msd加两种酶1μl,DNA模板28μl,无核酸酶水补足30μl总体积。实时荧光定量PCR反应体系为：引物Mix1.1μl,酶切产物5μl,PCR Master Mix13.75μl,无核酸酶水7.15μl,总体系27μl。反应条件为95℃预变性10min,97℃变性15sec,72℃延伸lmin,循环40次。应用METHYLSCREEN技术检测肺癌组织高甲基化百分比中位数为0.058166,未甲基化为0.923567,部分甲基化为0.000000。肺良性病变高甲基化百分比中位数为0.077580,未甲基化为0.922420,部分甲基化为0.000000。经秩和检验表明,肺癌组织PUMA基因中高甲基化、未甲基化、部分甲基化比例与肺良性病变组织相比的差异无统计学意义；不同性别年龄的肺癌患者之间PUMA基因高甲基化、未甲基化、部分甲基化的差异无统计学意义；肺癌各病理类型即鳞癌、腺癌和腺鳞癌之间PUMA基因高甲基化、未甲基化、部分甲基化百分比的差异无统计学意义。结论1. PUMA基因启动子与p53结合的BS1、BS2位点DNA序列在肺癌组织中结构十分稳定,无突变、插入或缺失改变。2. PUMA基因启动子CpG岛甲基化水平与肺癌无相关性,与肺癌的病理分型及性别年龄之间无相关性。

全文目录

中文摘要  6-8
Abstract  8-10
缩略语表  10-12
前言  12-17
  参考文献  15-17
第一部分肺癌组织中PUMA基因与p53结合位点BSI、BSZ序列分析  17-32
  实验材料  18-20
  实验方法  20-24
  结果  24-28
  讨论  28-30
  参考文献  30-32
第二部分 PUMA基因启动子甲基化与肺癌的相关性研究  32-55
  实验材料  33-35
  实验方法  35-41
  结果  41-49
  讨论  49-52
  参考文献  52-55
结论  55-56
文献综述  56-65
  参考文献  62-65
发表文章  65-66
致谢  66

PUMA基因BS1、BS2位点突变和启动子区甲基化与肺癌的相关性研究

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