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缺血后适应对急性缺血性脑梗死再灌注大鼠神经元凋亡的影响

作　者: 谭慧敏
导　师: 李燕
学　校: 昆明医学院
专　业: 神经病学
关键词: 脑缺血后适应神经保护 Bcl-2 Bax 凋亡
分类号: R743.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

【目的】：研究缺血后适应对于不同缺血程度的大鼠急性缺血性脑梗死(ischemic cerebral infarction, ISCI)再灌注后的神经保护效应以及缺血后适应对急性缺血性脑梗死再灌注后神经元凋亡的影响及Bcl-2(B-cell lymphoma-2 Bcl-2).Bax在其中的作用机制。探讨缺血后适应能否具有抑制凋亡而减轻局灶性脑缺血再灌注所诱导的神经功能及结构的损害,从而延长缺血性脑血管病治疗时间窗的作用。【方法】：本实验分成两部分。第一部分目的：研究缺血后适应对不同程度的大鼠急性缺血性脑梗死模型再灌注后梗死体积及神经功能评分的影响。国内外近期实验报道,缺血后适应对于缺血程度较轻,缺血时间较短的脑梗死动物模型具有明显的神经保护作用,然而缺血后适应对于缺血时间长,缺血程度较重的脑梗死是否具有保护效应目前研究还很少,国内有研究发现缺血后适应在大鼠大脑中动脉闭塞4.5小时后再灌注即刻进行,仍具有保护效应,国外几乎没有报道,因此本实验选择缺血4.5小时后进行缺血后适应干预,探讨其是否具有保护效应。方法：健康成年雄性SD大鼠24只,采用完全随机设计方法,按每组6只,随机分为假手术组、缺血2h再灌注组、缺血2h后适应组(后适应1组)、缺血4.5h后适应组(后适应2组)。用线栓法建立急性大脑中动脉闭塞的缺血性脑梗死模型,缺血再灌注组(Ischemia/reperfusion I/R)于缺血2h后实现再灌注损伤,缺血后适应1组、缺血后适应2组分别于缺血2h、4.5h后再灌注即刻进行缺血后适应即双侧颈总动脉10s/10s夹闭/开放5个循环,随后恢复动脉血流。再灌注后1h和24h给予神经功能评分,24h神经功能评分后直接断头取脑,做2mm厚的冠状切片,脑组织切片置于2%TTC染液中,避光、37℃孵育30min。白色部分为梗塞灶,红色部分为正常脑组织。采用数码照相机拍照后,梗塞面积的测定由一个对实验不知情者利用Image-Proplus6.0病理图文分析软件测量梗死面积。先描绘出梗死灶轮廓,测定梗死面积,再算出梗死体积,测定方法为用未梗死侧面积减去脑梗死侧未梗死区面积,得出梗死灶面积,各切片正反二面的梗死灶面积相加除以2所得平均值再乘以厚度,得出每个冠状面的梗死灶体积的近似值,5个冠状面的梗死灶体积相加就得出整个大鼠脑梗死体积。采用SPSS 11.5软件进行统计学分析,数据结果用均数±标准差(x±s)表示。因为假手术组指标数为零,为避免方差不齐,不参与统计分析。各组脑梗死体积先进行正态性检验,符合正态分布,再进行方差齐性检验,方差齐,采用单因素方差分析,p<0.05示差异有显著性。两两比较采用,S-N-K法；方差不齐,进行非参数检验(Kruskal-Wallis法),两两比较采用独立样本的t检验,根据比较的次数确定检验水准,因为假手术组不参与统计分析,各组之间共比较3次取α值为0.016；神经功能缺陷评分采用重复测量的方差分析。p<0.05示差异有显著性。【结果】：1、假手术组无梗死灶,脑缺血2h再灌注组、脑缺血4.5h后适应组可见沿左侧大脑半球大脑中动脉分布区白色大面积梗死灶,以脑缺血4.5h后适应组较明显；而脑缺血2h后适应组梗死较轻,在额顶部大脑皮质及基底节区仅见斑片状的小缺血灶。三组比较差别具有统计学意义F=61.945、p=0.000、p<0.05；进一步两两比较在α=0.016的水准上三组比较差别亦具有统计学意义。2、假手术组大鼠无神经功能缺陷体征。各脑缺血组出现不同程度的神经功能缺陷体征。不同时间之间、各处理组间,神经功能缺陷有显著差异,F值分别为(56.64,29.65)p值均为0.000。再灌注后1h神经功能评分三组之间差异无统计学意义,再灌注后24h神经功能评分三组之间差异具有统计学意义。缺血4.5h后适应组神经功能缺陷评分显著高于2h再灌注组及2h后适应组,而2h后适应组神经功能缺陷评分显著低于2h再灌注组及缺血4.5h后适应组,从每组各时间点看,2h再灌注组及2h后适应组的1h及24h神经功能缺陷评分比较,具有显著差异,t值分别为(4.04,7.06)p值分别为(0.002,0.000)(见表1-2)。缺血4.5h后适应组1h及24h神经功能缺陷评分比较差异无统计学意义。时间点与分组之间存在交互效应,即各组神经功能评分与时间有关,再灌注24内随着时间延长神经功能缺陷评分下降(F=8.75,p=0.001)。【结论】：缺血后适应能够减少大鼠急性缺血性脑梗死再灌注后的梗死体积,改善神经功能缺损症状,但如果缺血时间长,缺血较严重,保护效应减弱。第二部分目的：观察缺血后适应对大鼠急性缺血性脑梗死再灌注后HE染色情况的影响,应用TUNEL法及免疫组化方法观察其对神经元凋亡及相关Bcl-2(B-cell lymphoma-2 Bcl-2), Bax蛋白表达的影响,探讨缺血后适应能否具有通过抑制凋亡而产生神经保护的效应。方法：健康成年雄性SD大鼠24只,采用完全随机设计方法,按每组6只,随机分为假手术组、缺血2h再灌注组、缺血2h后适应组(后适应1组)、缺血4.5h后适应组(后适应2组)。同样用线栓法建立急性缺血性脑梗死模型,缺血2h再灌注组于缺血2h后实现再灌注损伤,缺血2h后适应组、缺血4.5h后适应组分别于缺血2h,4.5h后再灌注即刻进行缺血后适应,随后恢复动脉血流。于缺血后再灌注24h处死大鼠,以3.5%水合氯醛(1ml/100g)麻醉,自心尖灌注生理盐水250mL,再灌注4%多聚甲醛300mL后断头取脑。切取视交叉和其前2mm脑组织片进行石蜡包埋,制备4μm厚的石蜡切片。HE染色观察神经元形态变化；TUNEL法观察神经元凋亡数量；免疫组化观察Bcl-2、Bax蛋白表达情况。采用SPSS 11.5软件进行统计学分析,数据结果用均数±标准差(x±s)表示。因为假手术组各项指标数接近零,为避免方差不齐；不参与统计分析。神经元凋亡数目、Bcl-2、Bax免疫组化采用单因素方差分析p<0.05示差异有显著性。结果：缺血2h后适应组与缺血2h再灌注及缺血4.5h后适应组相比神经元变性、缺血、坏死数量明显较少,间质水肿较轻,细胞凋亡数显著减少,细胞Bcl-2蛋白表达增多,细胞Bax蛋白表达减少,其中缺血4.5h后适应组差异最显著。【结论】：双侧颈总动脉10s/10s夹闭/开放5个循环的缺血后适应,在大鼠缺血2小时再灌注即刻进行,对急性缺血性脑梗死具有保护作用,其机制可能为上调Bcl-2及下调Bax蛋白在缺血半暗带的表达,从而抑制细胞凋亡,保护缺血-再灌注脑组织,而10s/10s夹闭/开放5个循环的缺血后适应在大鼠缺血4.5小时再灌注即刻进行,不能抑制脑缺血-再灌注损伤时凋亡基因bax的表达,bcl-2蛋白表达明显降低。bcl-2抗凋亡的具体信号转导机制还需要进一步研究。

全文目录

中文摘要  6-9
英文摘要  9-13
前言  13-15
第一部分缺血后适应对急性缺血性脑梗死再灌注后大鼠梗死体积的影响  15-27
  1、主要实验材料  15-16
  2、实验方法  16-20
  3、结果  20-25
  4、讨论  25-27
第二部分缺血后适应对急性缺血性脑梗死再灌注后细胞凋亡数量及Bcl-2,Bax蛋白表达的影响  27-44
  1、主要实验材料  27-28
  2、实验方法  28-31
  3、结果  31-41
  4、讨论  41-44
结论  44-45
参考文献  45-47
综述  47-60
  参考文献  57-60
攻读学位期间发表文章  60-61
致谢  61

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