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福氏志贺氏菌2a 301株效应蛋白IpaH9.8功能研究

作　者: 赵江丽
导　师: 甄清；袁静
学　校: 吉林大学
专　业: 流行病与卫生统计学
关键词: 福氏志贺氏菌 IpaH9.8 基因敲除双间电泳磷酸化
分类号: R378
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

志贺氏菌属(Shigella spp.)又称为痢疾杆菌,是一类不形成芽孢的革兰氏阴性致病菌,临床上可引起细菌性痢疾。志贺氏菌属共有四个种48个血清型,包括痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)、宋内氏志贺氏菌(Shigella sonnei)和鲍氏志贺氏菌(Shigella boydii)。世界各地都有菌痢流行,全球每年的发病人数达到1.6亿,其中95%以上的死亡病例发生在发展中国家,我国每年菌痢的发病人数在40万以上,仅次于肝炎和结核。其中,福氏志贺氏菌是发展中国家尤其是我国引起细菌性痢疾的主要志贺氏菌种。细菌性痢疾在卫生条件较好的发达国家也时有爆发,在战时和有自然灾害的情况下发病率更高,严重影响作战部队的战斗力,也会对灾难救援工作产生极大不利影响。痢疾虽有药物治疗,但易转为慢性或长期带菌,且抗药性日趋严重。目前痢疾的治疗主要是依靠抗生素,然而耐药和多重耐药菌株的不断出现,增加了痢疾防治的难度,因此开展对志贺氏菌的遗传机制和致病机理研究,对开发研制有效的疫苗和新药具有重要价值。志贺氏菌感染人的肠道引起细菌性痢疾,其致病性依赖于Ⅲ型分泌系统(T3SS)。志贺氏菌与宿主上皮细胞接触后,激活Ⅲ型分泌系统,将毒力蛋白直接注入宿主细胞内,这些蛋白可影响细胞的功能,如使细胞皱膜、改变肌动蛋白骨架、激活宿主细胞信号通路、诱导巨噬细胞凋亡等。Ⅲ型分泌系统分泌的蛋白往往可使细菌在宿主细胞内存活又不过分伤及宿主,由此可见细菌与宿主在进化的过程中,细菌致病机制和宿主细胞存活之间具有一定的协调性。目前对志贺氏菌Ⅲ型分泌系统(T3SS)及效应子蛋白功能的研究已成为其致病性研究的热点。志贺氏菌的IpaH家族蛋白作为Ⅲ型分泌系统的效应子,其基因存在于染色体和毒力大质粒上。在福氏2a301株的毒力大质粒上存在5个ipaH基因的拷贝,分别是ipaH1.4、ipaH2.5、ipaH4.5、ipaH7.8、ipaH9.8。研究发现,IpaH9.8能下调宿主细胞内前炎性因子的表达,在志贺氏菌感染时明显抑制炎症反应,但目前其详细的功能及在志贺氏菌中的作用还不清楚。基因敲除是功能基因组学研究中的一个重要技术平台,也是病原微生物致病机理研究中必不可少的手段之一。在本研究中,我们利用λ-Red重组技术将福氏2a301株ipaH9.8基因敲除,然后分析突变株与野生株之间的表型与功能差异,获得与该基因功能相关的一些信息,从而达到阐述该蛋白功能的目的。首先将九噬菌体Red重组系统稍加改进,成功地敲除了志贺氏菌福氏2a301株的ipaH9.8基因,并利用低拷贝质粒构建了回复株,并分别用PCR和RT-PCR进行了验证；然后进一步测定野生株、缺失突变株和回复株生长曲线、生化反应,细胞侵袭实验、豚鼠角膜结膜感染实验、细胞因子检测和小鼠肺感染实验对野生株、缺失突变株和回复株的毒力表型进行比较分析。结果表明：野生株、缺失突变株和回复株的生长曲线基本一致,缺失突变株与野生株的生理生化反应没有明显差异,说明IpaH9.8对志贺氏菌的生长和基本生化代谢无影响。野生株、缺失突变株和回复株均能够侵袭进入Hela细胞和鼠巨噬细胞J774.A.1,使细胞核破裂,造成细胞死亡：细菌侵袭细胞后涂板计数,野生株、缺失突变株与回复株侵袭进入Hela细胞和J774.A.1细胞内的细菌数量无显著性差异,表明野生株、缺失突变株和回复株对Hela细胞和巨噬细胞的侵袭性没有明显区别,说明缺失ipaH9.8基因对志贺氏菌的侵袭能力影响不大。野生株、缺失突变株与回复株均能够引起豚鼠角膜结膜炎症反应,但缺失突变株的炎症反应更加强烈,推测IpaH9.8可能抑制宿主的炎症应答；因此,我们利用ELISA方法检测细菌侵袭细胞后的培养上清中细胞因子TNF-a和IL-1β的分泌情况,结果表明,与缺失突变株相比,野生株和回复株感染鼠巨噬细胞J774.A.1后明显抑制细胞产生TNF-a和IL-1β的能力；通过小鼠肺感染模型进一步证实了IpaH9.8能够抑制宿主的炎症反应。我们利用双向电泳和质谱技术对野生株、缺失突变株和回复株进行了全菌体蛋白的比较蛋白组学研究。在蛋白质组的比较分析中我们发现,共鉴定出43个蛋白点,对应23种蛋白质,与野生株和回复株相比,缺失突变株表达上调的蛋白为10个,表达下调的有15个,并且有1个蛋白对发生了位置的迁移。其中应激蛋白DnaK和GroEL表达下调,蛋白解聚分子伴侣的表达增加。最显著的差异是ipaH9.8基因的缺失引起了很多外膜蛋白的表达变化,包括NmpC、OmpF、OmpA、OmpA前体、OmpMxiD等,这些蛋白的变化都表明了IpaH9.8在一定程度上影响着志贺氏菌的侵袭能力和宿主的免疫反应。此外,还发现IpaH9.8诱导了长链脂肪酸外膜蛋白转运亍磷酸化与非磷酸化形式之问的转变。这些结果加深了我们对志贺氏菌效直至白IpaH9.8的认识,有助于志贺氏菌致病机理的进一步研究：上述研究中,生长曲线的测定和生化反应实验,深化了对褐氏志贺氏菌生理学特性的了解：细胞侵袭实验,为全面深入分析志贺氏菌的侵袭机制提供了掀其重要的线索；豚鼠角膜结膜感染实验的结果,为志贺氏菌免疫逃逸的研究奠定了基础。此外,比较蛋白质组学的研究设计,也拓展了筛选毒力相关蛋白的研究思路。研究中采用的技术改进以及获得的宝贵经验也为深入开展志贺氏菌致病机理的研究奠定了坚实的基础。

全文目录

中文摘要  4-7
Abstract  7-13
缩略语  13-14
第1章前言  14-25
  1.1 志贺氏菌的危害  14
  1.2 志贺氏菌的基本特征和分类  14-15
  1.3 志贺氏菌的致病过程  15-17
  1.4 志贺氏菌的Ⅲ型分泌系统(T3SS)及其效应子  17-22
  1.5 志贺氏菌的毒力大质粒上的毒力相关基因  22-23
  1.6 本研究的目的意义  23-25
第2章材料与方法  25-41
  2.1 实验材料  25-29
    2.1.1 细胞系、菌株和质粒  25
    2.1.2 实验动物  25
    2.1.3 主要试剂  25-27
    2.1.4 主要仪器  27
    2.1.5 引物设计  27-29
  2.2 实验方法  29-41
    2.2.1 ipaH9.8基因缺失突变株和回复株的构建及鉴定  29-34
    2.2.2 ipaH9.8基因突变株的毒力表型分析  34-36
    2.2.3 ipaH9.8突变株与野生株比较蛋白质组学研究  36-41
第3章实验结果  41-57
  3.1 ipaH9.8基因缺失突变株和回复株的构建及鉴定  41-45
    3.1.1 长同源臂突变盒的构建  41-42
    3.1.2 志贺氏菌福氏2a 301△ipaH9.8突变体的构建  42
    3.1.3 ipaH9.8基因缺失突变株和回复株的验证  42-45
  3.2 ipaH9.8基因突变株的毒力表型分析  45-51
    3.2.1 突变株、回复株与野生株生长状态的测定  45
    3.2.2 缺失突变株、回复株与野生株的生化实验鉴定比较  45-46
    3.2.3 缺失突变株、回复株与野生株细胞侵袭实验比较  46-48
    3.2.4 缺失突变株、回复株与野生株豚鼠角膜实验(Sereny Test)比较  48-49
    3.2.5 鼠J774.A.1细胞感染后细胞因子检测  49-50
    3.2.6 小鼠肺侵袭实验检测  50-51
  3.3 ipaH9.8突变株与野生株比较蛋白质组学研究  51-57
    3.3.1 ipaH9.8基因突变株与野生株双向电泳的图谱比较  51-54
    3.3.2 质谱鉴定和结果查询  54-55
    3.3.3 Pro-Q Diamond染色进行翻译后修饰蛋白磷酸化的鉴定  55-57
第4章讨论  57-64
  4.1 ipaH9.8基因缺失突变株和回复株的构建及鉴定  57-58
  4.2 ipaH9.8基因突变株的毒力表型分析  58-60
    4.2.1 缺失突变株、回复株与野生株生长状态的测定  58
    4.2.2 缺失突变株、回复株与野生株生化实验的比较  58
    4.2.3 缺失突变株、回复株与野生株细胞侵袭实验比较  58-59
    4.2.4 缺失突变株、回复株与野生株豚鼠角膜结膜感染实验比较  59
    4.2.5 鼠J774.A.1细胞感染后细胞因子检测  59
    4.2.6 小鼠肺侵袭实验  59-60
  4.3 ipaH9.8突变株与野生株比较蛋白质组学研究  60-64
    4.3.1 质谱结果分析  60-63
    4.3.2 翻译后修饰蛋白磷酸化的鉴定  63
    4.3.3 假想蛋白  63-64
第5章结论  64-65
参考文献  65-71
个人简介及在学期间所取得的科研成果  71-72
致谢  72

福氏志贺氏菌2a 301株效应蛋白IpaH9.8功能研究

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