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ES小鼠的制备及SP-B mRNA的表达分析

作　者: 吴兴龙
导　师: 李相运
学　校: 河北农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: ES小鼠呼吸衰竭综合征肺表面活性蛋白B 四倍体胚胎 ECCD-1 显微注射
分类号: S865.13
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

ES小鼠属于克隆小鼠,是研究人类疾病的最佳模式动物。利用四倍体胚胎补偿技术可以得到完全由ES细胞发育而来的小鼠,即ES小鼠。尽管四倍体胚胎补偿技术获得了大家的公认,但采用这一技术制备ES小鼠的效率较低,其影响因素很多。如四倍体胚胎的制作方法和遗传背景、体外培养环境、ES细胞的传代次数等都是影响获得ES小鼠的重要因素。四倍体胚胎发育阶段也是其中的一个重要因素,关于四倍体胚胎发育阶段对ES小鼠制备的研究目前还没有。新生有活力的ES小鼠(有短暂的呼吸现象)并非都能发育至成年,有相当一部分在出生后立刻表现进行性呼吸困难和青紫呼吸衰竭征象,其寿命不会超过1小时,肺部病理表现为肺泡壁增厚和肺泡扩张不全,而且,这种呼吸衰竭征是导致新生ES小鼠死亡的主要疾病。死于呼吸衰竭的新生ES小鼠几乎没有SP-B蛋白的表达,即使那些外观正常的成年ES小鼠的SP-B蛋白表达水平也很低。因此SP-B基因很可能是一个确保新生克隆动物存活至成年的关键基因。通过2-细胞胚胎电融合法制备四倍体胚胎,采用显微注射方法将ES细胞分别注入1-细胞、4-细胞、囊胚三个发育阶段的四倍体胚胎中。所用ES细胞分别为杂交系B6D2F1×129/Sv和近交系C57BL/6J,经胚胎移植和剖腹产获得ES小鼠。结果显示,杂交ES细胞注射四倍体囊胚获得40只ES小鼠,效率显著高于近交系ES细胞以及其他发育阶段的四倍体胚胎,ES小鼠与B6D2F1×129/Sv杂交小鼠毛色一致且具有正常生殖能力。实验中,我们还研究了E型钙粘连蛋白抗体(ECCD-1)对胚胎体外发育的影响,并利用ECCD-1处理8细胞胚胎注射ES细胞方法产生嵌合体。结果表明,ECCD-1阻止了胚胎分裂球间的连接,推迟致密化过程,但不影响囊胚ICM的形成。ECCD-1培养8-细胞胚胎注射ES细胞也能获得完全由ES细胞发育而来的小鼠。分别取14只死于呼吸衰竭的新生ES小鼠和14只新生正常小鼠(相同遗传背景)的肺组织,提取RNA。用半定量PCR方法检测SP-B mRNA的表达水平,结果表明死于呼吸衰竭的新生ES小鼠肺脏组织中的SP-B mRNA表达减少。这些结果说明,新生克隆动物的呼吸衰竭征很可能是由于SP-B的异常表达引起的。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
1 引言  9-16
  1.1 小鼠早期胚胎的发育  9
  1.2 ES 小鼠的制备与核移植小鼠  9-11
    1.2.1 四倍体胚胎互补技术  9-10
    1.2.2 ES 小鼠的制备  10-11
  1.3 呼吸衰竭征与肺表面活性蛋白B（SP-B）的关系  11-14
    1.3.1 呼吸衰竭征  12
    1.3.2 肺表面活性蛋白B(SP-B)  12-13
    1.3.3 SP-B 蛋白与呼吸衰竭征的关系  13-14
  1.4 本研究的目的、意义  14-16
2 材料与方法  16-27
  2.1 实验动物  16
  2.2 主要试剂  16-17
  2.3 主要设备  17-18
  2.4 主要溶液配制方法  18-20
  2.5 实验方法  20-27
    2.5.1 ES 小鼠的制备  20-22
    2.5.2 ECCD-1 对胚胎体外发育影响的研究  22-23
    2.5.3 SP-B mRNA 在 ES 小鼠中的表达分析  23-27
3 结果与分析  27-36
  3.1 胚胎发育阶段对ES 小鼠制备的影响  27-28
  3.2 ES 细胞遗传背景对产生ES 小鼠的影响  28-31
  3.3 ECCD-1 延迟植入前胚胎的致密化  31
  3.4 ECCD-1 不会影响囊胚ICM 的形成  31-34
  3.5 SP-B mRNA 的表达分析  34-36
4 讨论  36-40
  4.1 胚胎发育阶段对ES 小鼠制备的影响  36-37
  4.2 ECCD-1 对胚胎体外发育的影响  37-38
  4.3 SP-B 蛋白与ES 小鼠呼吸衰竭征的关系  38-40
5 结论  40-41
参考文献  41-48
在读期间发表的论文  48-49
作者简历  49-50
致谢  50-51

ES小鼠的制备及SP-B mRNA的表达分析

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