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胶质类芽孢杆菌3016全基因组测序及菌种水平特异分子标识的筛选和鉴定

作　者: 王璇
导　师: 丁延芹；李俊
学　校: 山东农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 微生物肥料胶质类芽孢杆菌全基因组序列特异引物快速鉴别
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

胶质类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)是微生物肥料广泛应用的功能菌种之一,菌体自身通过代谢产生有机酸、氨基酸、多糖、激素等物质促进植物的生长,并且能够分解含钾矿物,释放出钾及其他营养元素,有些菌株还具备溶磷和固氮功能。胶质类芽孢杆菌在农业生产中表现出提高土壤速效钾与速效磷含量、促进作物生长、提高作物产量和品质等多方面的效应,一直是微生物肥料研发的重点和热点之一。本论文以实验室分离得到14株胶质类芽孢杆菌为实验材料,进行了形态学观察、生理生化测定、16SrDNA和gyr B基因测序、系统发育分析。通过溶磷、解钾、固氮等生物学功能的测定比较,从中筛选得到了一株高效多功能优良菌株,编号为P. mucilaginosus 3016。该菌株的溶磷、解钾效果分别比对照增加至187.8%和131.4%,固氮酶活性为3.51nmol(C2H4)/h·mg(蛋白),发酵液中产生的苹果酸和乙酸分别比对照增加89.9%和277.7%,同时产生少量柠檬酸(3.74mg/L)、生长素(0.03mg/L)和赤霉素(1.01mg/L),对植株具有一定的促生能力。采用Sanger测序方法与454高通量测序相结合的方法,对P. mucilaginosus 3016菌株全基因组序列进行测序,利用SOAP de novo v1.04、454 Newbler v2.3软件进行序列的拼接,获得全基因组序列精细图谱。通过基因组序列拼接、空缺填补和低质量序列校验等工作后,绘制了3016菌株全基因组序列图谱,并应用生物信息学方法对基因组进行了注释。利用比较基因组学分析手段,根据3016菌株全基因组序列,选择胶质类芽孢杆菌特异性片段为靶基因,设计特异性引物。通过PCR条件的优化和特异性、灵敏度的验证,筛选得到一对胶质类芽孢杆菌的特异引物(orf06701-F:5’-ATGGAGGAAACATG GGGTGA-3’/orf06701-R:5’-TCAGGAATGAAGGCCCCCTT-3’),建立了胶质类芽孢杆菌快速鉴别方法。研究表明,该引物仅能在以胶质类芽孢杆菌为模板时特异性扩增333bp保守序列,其检出灵敏限度为每微升反应体系400-1000个细胞,以实验选取的其他参比菌株为模板时并不能扩出该序列,该引物具有良好的特异性;同时,用该方法成功地鉴定了从土壤中分离得到的胶质类芽孢杆菌,并且得到的特异性片段序列同源性达到100%。本文对一株P. mucilaginosus 3016进行全基因组测序,该菌株是一株具有溶磷、解钾、固氮等多项生物学功能,微生物肥料重要功能菌之一。同时,筛选并鉴定了一对特异引物,建立了一套快速鉴别胶质类芽孢杆菌的方法,为微生物肥料中胶质类芽孢杆菌的检测及生态评价提供技术支撑。

全文目录

中文摘要  8-10
英文摘要  10-12
1 前言  12-32
  1.1 胶质类芽孢杆菌研究现状  12-17
    1.1.1 胶质类芽孢杆菌简介  12
    1.1.2 胶质类芽孢杆菌的分类地位  12-13
    1.1.3 胶质类芽孢杆菌形态特征及生理生化性质  13
    1.1.4 胶质类芽孢杆菌的增产机理  13-17
  1.2 微生物基因组学研究进展  17-25
    1.2.1 DNA 测序和基因组学新型技术  17-23
    1.2.2 微生物基因组学  23-25
  1.3 基于PCR 技术的菌种检测  25-29
    1.3.1 特异PCR 检测方法  26-27
    1.3.2 常用靶基因的比较  27-29
  1.4 研究目的和意义  29-30
  1.5 研究内容和技术路线  30-32
    1.5.1 研究内容及方法  30-31
    1.5.2 技术路线  31-32
2 材料与方法  32-61
  2.1 高效多功能胶质类芽孢杆菌的筛选及生物学功能分析  32-46
    2.1.1 菌株  32
    2.1.2 试验药品及试剂  32-34
    2.1.3 主要仪器  34-35
    2.1.4 培养基  35-36
    2.1.5 菌种的纯化和保存  36
    2.1.6 生理生化实验  36-38
    2.1.7 总DNA 的提取与纯度检测  38-39
    2.1.8 16S rDNA 序列及gyr B 基因序列PCR 扩增及产物纯化  39-41
    2.1.9 目的产物的测序  41-42
    2.1.10 类芽孢杆菌属16S rDNA 特异性片段扩增  42-43
    2.1.11 菌株生物学功能分析  43-46
  2.2 胶质类芽孢杆菌3016 全基因组测序  46-54
    2.2.1 菌株  46
    2.2.2 质粒载体  46
    2.2.3 工具酶及DNA 分子量标准  46-47
    2.2.4 试剂盒  47
    2.2.5 主要试剂及材料  47
    2.2.6 主要溶液  47-48
    2.2.7 主要仪器及设备  48
    2.2.8 培养基  48
    2.2.9 鸟枪法基因组文库的构建  48-49
    2.2.10 基因组文库的大规模测序  49-51
    2.2.11 基因组454 高通量测序  51-54
    2.2.12 胶质类芽孢杆菌3016 菌株基因组拼接  54
    2.2.13 胶质类芽孢杆菌3016 菌株基因组初步注释  54
  2.3 胶质类芽孢杆菌菌种水平特异性分子标识的筛选和鉴定  54-61
    2.3.1 菌株  54-55
    2.3.2 试验药品及试剂  55-56
    2.3.3 主要仪器  56
    2.3.4 培养基  56
    2.3.5 菌种的纯化和保存  56
    2.3.6 总DNA 的提取与纯度检测  56
    2.3.7 特异性引物的设计和筛选  56-57
    2.3.8 最优PCR 条件的建立及验证  57-59
    2.3.9 应用于土壤样品的特异性检测  59-61
3 结果与分析  61-81
  3.1 高效多功能胶质类芽孢杆菌的筛选及生物学功能分析结果  61-70
    3.1.1 形态学与生理生化特征  61-62
    3.1.2 供试菌株总DNA 提取  62
    3.1.3 基于16S rDNA 序列的系统进化分析  62-65
    3.1.4 基于gyr B 基因序列的系统进化分析  65-67
    3.1.5 类芽孢杆菌特异性片段扩增  67
    3.1.6 菌株解钾、溶磷、固氮能力的研究结果  67-70
    3.1.7 菌株3016 发酵液中植物激素和有机酸的测定结果  70
  3.2 胶质类芽孢杆菌3016 全基因组测序结果  70-72
    3.2.1 胶质类芽孢杆菌3016 基因组序列破译  70
    3.2.2 胶质类芽孢杆菌3016 基因组注释  70-72
    3.2.3 胶质类芽孢杆菌3016 基因组环形图谱  72
  3.3 胶质类芽孢杆菌菌种水平特异性分子标识的筛选及鉴定结果  72-81
    3.3.1 参考菌株总DNA 的提取结果  72-73
    3.3.2 PCR 条件的优化和验证  73-77
    3.3.3 应用于土壤样品的特异性检测结果  77-81
4 讨论  81-85
  4.1 高效多功能胶质类芽孢杆菌的筛选及生物学功能分析  81-82
  4.2 胶质类芽孢杆菌3016 全基因组测序  82
  4.3 胶质类芽孢杆菌菌种水平特异性分子标识的筛选及鉴定  82-85
    4.3.1 引物设计  82-83
    4.3.2 PCR 特异性与灵敏度  83-85
5 结论  85-86
参考文献  86-97
致谢  97-98
攻读学位期间发表论文情况  98

胶质类芽孢杆菌3016全基因组测序及菌种水平特异分子标识的筛选和鉴定

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