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CIAV M突变株致病性试验及其在DF-1上生长适应性的研究

作　者: 孙丹丹
导　师: 史万玉；杨兵
学　校: 河北农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 鸡传染性贫血病毒 CIAV M突变株致病性 DF-1细胞系生长适应性
分类号: S858.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

鸡传染性贫血病毒（Chicken infectious anemia virus, CIAV）为鸡传染性贫血病（Chicken infectious anemia, CIA）的病原,属圆环病毒科（Circoviridae）,为单股、负义、共价结合的环状DNA。CIAV基因组只产生一个具有多顺反子特性的转录子。转录子上有三个AUG密码子,使其内部形成三个开放阅读框架（Open reading frames,ORFs）,其中ORF3（366bp）位于OFR2（651bp）内,ORF2与ORF1（1350bp）部分重叠。ORFs分别编码VP3（13kD）、VP2（24kD）和VPl（52kD）三种病毒蛋白。VP1为结构蛋白,是中和抗原位点的组成部分;VP2为VP1的伴侣蛋白或骨架蛋白,与VP1在宿主细胞内共同诱发机体产生中和抗体;VP3是CIAV的主要致病性蛋白,可诱导细胞凋亡。北京市农林科学院高新技术实验室夏永恒等人采用PCR定点突变技术使编码CIAV VP3的起始密码子后移了39位,造成VP3的不完全表达,成功构建了pTCAVm阳性克隆株并初次获得了感染性克隆。本试验将从重组阳性克隆株开始,继续研究CIAV M突变体的致病性和其对DF-1细胞系的嗜性,为寻找更好的研制CIA减毒活疫苗的方案奠定基础。本试验选取保存于-80℃的pTCAVm阳性克隆株,按照夏永恒等人将突变株体外环化的试验方法,重新复壮pTCAVm重组菌株,提取重组质粒,酶切鉴定后,使CIAV突变基因自身环化。用脂质体转染方法,将自身环化突变株转染到MDCC-MSB1宿主细胞内,并采用IFA及RT-PCR方法进行转染细胞内病毒复制情况的检测及CIAV序列测定,试验结果证明本试验同样获得了具有感染性的突变株-CIAV M突变株。用人工腹腔注射方法,将CIAV M突变株毒液接种于1日龄SPF鸡,并动态追踪CIAV M突变株在SPF鸡体内的致病性及在SPF鸡体内传代一次后对宿主细胞的致病性。用IFA方法,测得的CIAV M突变株的TCID₅₀值为10^4.5/mL;通过临床剖检变化及病理切片方法观察到:7、14、21日龄时,CIAV M突变株能够引起SPF鸡增重缓慢,胸腺等免疫器官内T淋巴细胞消失、组织萎缩,鸡腿骨骨髓颜色变为黄粉色,红细胞容积值显著下降等CIA的特征性病变;体内CIAV抗体水平检测结果显示:抗体水平表现为弱阳性,提示CIAV M突变株具有抗原性;采用流式细胞术测定感染的宿主细胞生长周期及细胞凋亡情况,试验结果显示:回归动物试验后的CIAV M突变株对MDCC-MSB1宿主细胞周期无明显阻滞作用,但其具有致宿主细胞凋亡作用。通过与CUX-1标准毒株的同行比较,整个试验结果显示:CIAV M突变株具有感染性,但其致病性明显减弱。CIAV在MDCC-MSB1宿主细胞的病毒滴度较低,不利于CIAV的疫苗生产,因此本试验还试探性的将CIAV M突变株接种于DF-1细胞系中,为CIAV M突变株寻找一种新的生长细胞系。将CIAV M突变株接种于DF-1细胞系,经过5-7天的培养,六个重复组没有全部出现纤维细胞拉网、变圆等细胞病变;再次传代时,采用盲传方法,接种毒液为上一代细胞反复冻融获得的或直接从细胞板刮取的,经过5-7天的培养,六个重复组仍然没有全部出现细胞病变。CIAV M突变株通过接种于DF-1细胞系,传代15次,用PCR方法检测每代收取的细胞液,并利用IFA和RT-PCR方法验证PCR检测结果为阳性的样品,但后两种方法均未检测出阳性样品中的CIAV。根据整个试验结果推断:CIAV M突变株不能在DF-1上适应性生长,其可能不具有特殊的DF-1细胞系嗜性。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-12
1 前言  12-26
  1.1 CIAV 的历史背景  12-13
  1.2 CIAV 的基因与生长繁殖  13-15
    1.2.1 CIAV 的基因组结构  13
    1.2.2 CIAV 对理化因素的抵抗力  13-14
    1.2.3 CIAV 的遗传变异  14
    1.2.4 CIAV 的分离与繁殖  14-15
  1.3 CIAV 的复制与转录  15-16
    1.3.1 CIAV 的复制  15
    1.3.2 CIAV 的转录  15-16
  1.4 CIAV 的编码蛋白及其功能  16-19
    1.4.1 病毒蛋白VP1  16-17
    1.4.2 病毒蛋白VP2  17
    1.4.3 病毒蛋白VP3  17-19
  1.5 CIAV 的致病性  19-20
  1.6 CIAV 的检测方法  20-23
    1.6.1 经典病原学检测方法  21
    1.6.2 血清学诊断  21-22
    1.6.3 CIAV 的DNA 检测  22-23
    1.6.4 鉴别诊断方法  23
  1.7 CIA 的预防与控制  23-25
    1.7.1 CIA 的管理措施  23
    1.7.2 预防CIA 的免疫接种  23-25
  1.8 本研究的目的及意义  25-26
2 材料与方法  26-36
  2.1 毒株、细胞和动物  26
  2.2 主要试剂  26
  2.3 所用培养基和溶液的配置  26-28
  2.4 所用仪器设备  28
  2.5 方法  28-36
    2.5.1 CIAV VP3 基因突变体pTCAVm 阳性克隆株体外的自身环化及MDCC-MSB1 细胞转染  28-29
    2.5.2 转染的MDCC-MSB1 细胞内病毒的间接免疫荧光检测  29
    2.5.3 转染的MDCC-MSB1 细胞内病毒的RT-PCR 检测  29-30
    2.5.4 CIAV M 突变株TCID_(50) 的测定  30-31
    2.5.5 感染CIAV M 突变株的SPF 鸡不同日龄的临床指标检测  31-33
    2.5.7 回动物后CIAV M 突变株对MDCC-MSB1 宿主细胞的细胞周期及凋亡的影响  33
    2.5.8 回动物后CIAV M 突变株在DF-1 上的生长适应性  33-35
    2.5.9 数据处理  35-36
3 结果  36-47
  3.1 CIAV VP3 基因突变体pTCAVm 阳性克隆株提取质粒的酶切鉴定  36
  3.2 转染MDCC-MSB1 细胞的生长情况  36-37
  3.3 转染MDCC-MSB1 细胞内CIAV 病毒的RT-PCR 的鉴定及序列测定结果  37-38
  3.4 转染细胞内CIAV M 突变株的间接免疫荧光法检测结果  38
  3.5 CIAV M 突变株TCID_(50) 的测定结果  38-39
  3.6 CIAV M 突变株人工感染鸡的临床症状  39-41
    3.6.1 回归动物试验后CIAV M 突变株的序列测定结果  39
    3.6.2 人工感染鸡的临床表现及剖检病变  39-40
    3.6.3 人工感染鸡的红细胞容积值的变化  40-41
  3.7 CIAV M 突变株人工感染鸡主要免疫器官的组织学病变  41-42
  3.8 CIAV M 突变株人工感染鸡体内CIAV 抗体水平的测定  42-43
  3.9 回归动物后 CIAV M 突变株对宿主细胞 MDCC-MSB1 的细胞周期及其凋亡的影响  43-44
    3.9.1 流式细胞术检测细胞周期结果  43-44
    3.9.2 流式细胞术检测细胞凋亡结果  44
  3.10 回归动物后 CIAV M 突变株在 DF-1 上生长适应性研究结果  44-47
    3.10.1 接毒DF-1 细胞的生长情况  44-45
    3.10.2 接毒DF-1 细胞内CIAV 的PCR 检测  45-46
    3.10.3 PCR 检测结果为阳性的细胞的RT-PCR 和间接免疫荧光鉴定  46-47
4 讨论  47-51
  4.1 CIAV M 突变株转染MDCC-MSB1 细胞结果分析  47-48
  4.2 CIAV M 突变株对SPF 鸡致病力的检测结果分析  48
  4.3 回归动物后 CIAV M 突变株对 MDCC-MSB1 的细胞生长周期及细胞凋亡检测结果分析  48-49
  4.4 回归动物后CIAV M 突变株在DF-1 上生长适应性的结果分析  49-51
5 结论  51-52
参考文献  52-62
作者简历  62-63
在读期间发表的学术论文  63-64
致谢  64-65

CIAV M突变株致病性试验及其在DF-1上生长适应性的研究

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