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结核分枝杆菌膜蛋白Rv0849功能和免疫学特性的研究

作　者: 胡志东
导　师: 王洪海；曹健
学　校: 河南工业大学
专　业: 微生物学
关键词: 结核分枝杆菌 H37Rv0849 耻垢分枝杆菌 外排泵
分类号: R52
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


结核病是由结核分枝杆菌引起的一种世界性传染病。据世界卫生组织报告,目前全球有二十多亿人感染了MTB,占世界总人口的三分之一。其中,每十人中就有一人在其一生中会罹患活动性结核。近年来,耐多药结核病的出现以及MTB与人免疫缺陷病毒的共感染,使结核病更加难以控制。卡介苗是目前许多国家批准应用于人体的唯一结核疫苗。但是,新生儿接种卡介苗后,免疫保护力会随年龄的增长而下降,而且卡介苗只对预防原发性结核有效,对已感染患者没有保护作用。因此,研制开发新型防治结核病药物和疫苗迫在眉睫。在细菌体内,膜蛋白扮演着至关重要的作用,例如:细胞间的相互作用、离子和营养物质的转运、细胞信号以及参与和致病性相关的细胞反应等。其中,药物外排泵是细菌膜蛋白比较重要的功能之一,并且,细菌的主动外排是导致其产生多重耐药的重要原因。另外,大多数膜蛋白直接暴露在细胞表面,与宿主免疫活性细胞的相应膜受体相互作用,刺激细胞和体液免疫的形成,具有良好的免疫原性。因此,编码膜蛋白特别是外排泵的基因被认为是治疗药物和疫苗开发的主要靶点所在。Rv0849是结核分枝杆菌一个编码保守膜蛋白的基因,功能诠释为药物的外排泵,属于主要易化子超家族。TMHMM分析其含有12个跨膜区,具有较好的免疫原性。目前国内外尚未见到关于此蛋白功能和免疫特性的报道。基于此,为探讨Rv0849的特性与功能,从H37Rv基因组中扩增获得Rv0849基因,酶切后连接到分枝杆菌穿梭质粒pMV261上构建重组质粒pMV0849,并以耻垢分枝杆菌为载体构建获得重组菌株SM::0849。然后以此带有重组耻垢分枝杆菌为研究对象,检测到重组菌株对荧光染料的通透性有一定变化,但对所测药物的耐受没有显著增加。表明此蛋白作为外排泵参与了细胞的一部分转运功能,但可能与药物外排无关。另外,我们对重组菌株免疫诱导C57BL/6小鼠产生的免疫应答反应进行评价,发现重组菌株能够较好地诱导小鼠体液免疫应答水平并较强地刺激小鼠脾脏淋巴细胞分泌肿瘤坏死因子-α和γ-干扰素。研究结果提示结核分枝杆菌H37Rv膜蛋白编码基因Rv0849所编码的蛋白可能成为一种新的免疫抗原。综上所述,本实验为结核菌外排泵及其机制的研究和抗结核重组疫苗的研究打下基础。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-9
主要符号表  9-10
第一章 前言  10-27
  1.1 结核病概况  10-16
    1.1.1 结核病的历史和现状  10-12
    1.1.2 结核病及其病原  12-15
    1.1.3 结核病的诊断和治疗  15-16
  1.2 抗结核药物耐药机制  16-20
    1.2.1 耐药的概念及其在临床上的分类  17
    1.2.2 抗结核药物的耐药机制  17-20
  1.3 外排泵系统与结核病耐药  20-24
    1.3.1 外排泵及其分类  20-21
    1.3.2 结核分枝杆菌外排泵研究进展  21-23
    1.3.3 外排泵抑制剂研究  23-24
  1.4 本研究的目的和意义  24-26
  1.5 本研究的主要内容  26-27
第二章 实验材料与方法  27-37
  2.1 实验材料和仪器  27-28
    2.1.1 实验材料  27
    2.1.2 实验仪器  27-28
  2.2 实验方法  28-37
    2.2.1 Rv0849的克隆、表达与纯化  28-33
    2.2.2 Rv0849的药泵功能和转运功能的初步探讨  33-35
    2.2.3 Rv0849的免疫学特性的初步检测  35-37
第三章 结果与讨论  37-48
  3.1 Rv0849的克隆，表达，纯化  37-39
    3.1.1 PCR扩增产物的鉴定  37
    3.1.2 重组质粒的鉴定  37
    3.1.3 重组蛋白的诱导表达  37-38
    3.1.4 重组蛋白的亲和纯化  38-39
    3.1.5 讨论  39
  3.2 Rv0849的药泵功能和转运功能的初步探讨  39-44
    3.2.1 重组耻垢分枝杆菌的转化鉴定  39-40
    3.2.2 重组菌株MIC测定  40-41
    3.2.3 重组菌株的荧光变化测定  41-42
    3.2.4 重组菌株生长曲线测定  42-43
    3.2.5 讨论  43-44
  3.3 Rv0849的免疫学特性的初步检测  44-48
    3.3.1 重组耻垢分枝杆菌免疫小鼠血清IgG的分泌  44-45
    3.3.2 重组耻垢分枝杆菌对感染小鼠细胞免疫水平的影响  45-46
    3.3.3 讨论  46-48
第四章 结论  48-49
参考文献  49-54
附录  54-63
致谢  63-64
个人简历  64
攻读硕士学位期间论文发表情况  64

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 结核病
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