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费氏丙酸杆菌费氏亚种亚油酸异构酶的研究

作　者: 李凤娟
导　师: 曹健；罗宇
学　校: 河南工业大学
专　业: 微生物学
关键词: 费氏丙酸杆菌费氏亚种亚油酸异构酶发酵条件有机相酶催化固定化酶
分类号: Q814
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

共轭亚油酸的活性异构体具有抗癌、延缓机体衰老等多种生理功能。生物转化法生产共轭亚油酸异构体较单一,生理活性异构体的含量高。本文对费氏丙酸杆菌费氏亚种(Propionibacterium freudenreichii ssp. freudenreichii)CGMCC1.2236生物转化法生产CLA进行了研究。首先,通过GC法和UV法对CLA含量测定的平行性探讨得出,UV法易受培养基成分和底物杂质的干扰,GC法是检测CLA含量的精确可靠的方法。通过比浊法测定费氏丙酸杆菌费氏亚种生长曲线可知,菌体在0~4 h处于生长延滞期,4~16 h进入对数生长期,16~20 h进入生长稳定期,20 h后进入衰亡期,且发酵开始时添加0.1%(v/v)LA对费氏丙酸杆菌费氏亚种的生长有较大的抑制作用。测定发酵液、细胞内容物、菌体碎片的酶活表明,费氏丙酸杆菌费氏亚种CGMCC1.2236亚油酸异构酶为膜结合酶。影响酶活力的因素研究表明,微氧条件下有利于提高酶活力,约为有氧条件下的3.7倍。在反应体系中添加一定量的抗氧化剂可以显著提高酶活力,添加200μL的1%VC溶液,亚油酸异构酶活力为51.6 U/mL,比在微氧条件下提高了3.2倍。其次,本文对费氏丙酸杆菌费氏亚种转化亚油酸生成CLA发酵条件进行了研究,通过单因素实验及Box-Behnken中心组合实验设计,确定了最佳发酵条件:培养基中葡萄糖浓度2.11%,尿素浓度0.95%,初始pH6.52。在此条件下,CLA的产量为3.18μg/mL,是优化前的8.4倍,CLA产量有了较大的提高。再次,本文对有机相中细胞干粉转化亚油酸生成CLA进行了研究,通过正交实验,确定了最佳工艺条件:50 mL具塞三角瓶中分别加入10 mL正庚烷、0.05 g细胞干粉、100μL亚油酸、70μL水,微氧环境下,35℃水浴摇床上,250 rpm振摇反应24 h,CLA产量为6.23μg/mL,比优化前提高了3.2倍,是发酵最优值的2.0倍。经过5次循环反应后,细胞干粉保持着初始活力的52%,这是首次在有机相中对亚油酸异构酶细胞干粉转化亚油酸生成CLA的影响因素进行的优化研究。最后,考虑到工业生产过程中,固定化细胞更便于催化剂的回收利用,对固定化载体进行了初步筛选。结果表明醋酸纤维素包埋法效果最好,CLA产量为8.00μg/mL,比全细胞催化的产量高出1.77μg/mL。固定化细胞经过5次循环反应后,保持着初始活力的61%,其中前三次使用后产量为首次使用的92%。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
第一章前言  10-23
  1.1 CLA 的结构和生物学功能  10-11
  1.2 CLA 的来源与合成  11-12
    1.2.1 CLA 天然来源  11
    1.2.2 CLA 化学合成  11
    1.2.3 CLA 生物合成  11-12
  1.3 亚油酸异构酶的研究概况  12-14
    1.3.1 亚油酸异构酶的分离纯化  12
    1.3.2 亚油酸异构酶的性质  12-14
  1.4 亚油酸异构酶分子生物学研究  14-19
    1.4.1 油酸异构酶基因的克隆与序列分析  14-17
    1.4.2 亚油酸异构酶表达系统  17-19
    1.4.3 亚油酸异构酶催化机理  19
  1.5 亚油酸异构酶在有机相中的反应研究  19-22
    1.5.1 在非水相中的研究  19-20
    1.5.2 非水相酶催化过程中的影响因素  20-22
    1.5.3 亚油酸异构酶的有机相反应  22
  1.6 本课题研究的目的及意义  22
  1.7 本课题研究的主要内容  22-23
第二章 CLA 检测方法的建立及亚油酸异构酶的初步研究  23-35
  2.1 材料与方法  23-28
    2.1.1 菌种  23
    2.1.2 培养基  23-24
    2.1.3 主要仪器设备  24
    2.1.4 主要试剂  24-25
    2.1.5 培养方法  25-26
    2.1.6 生长曲线的测定  26
    2.1.7 生长过程中菌液pH 值的测定  26
    2.1.8 CLA 紫外吸收标准曲线的测定  26
    2.1.9 脂肪酸的提取  26
    2.1.10 脂肪酸的甲酯化  26-27
    2.1.11 CLA 的检测  27
    2.1.12 不同来源的酶液催化  27
    2.1.13 亚油酸异构酶酶活力的测定  27-28
  2.2 结果与讨论  28-34
    2.2.1 费氏丙酸杆菌费氏亚种生长曲线  28
    2.2.2 费氏丙酸杆菌费氏亚种生长过程中菌液pH 值变化  28-29
    2.2.3 CLA 紫外吸收标准曲线  29-30
    2.2.4 GC 法对CLA 的测定  30-31
    2.2.5 UV 法和GC 法对CLA 测定平行性分析  31-32
    2.2.6 不同来源的酶液的酶活  32
    2.2.7 氧气对酶活力的影响  32-33
    2.2.8 抗氧化剂对酶活力的影响  33-34
  2.3 本章小结  34-35
第三章费氏丙酸杆菌费氏亚种转化亚油酸生成CLA 的发酵优化  35-47
  3.1 材料与方法  35-37
    3.1.1 菌种  35
    3.1.2 培养基  35
    3.1.3 主要仪器设备  35
    3.1.4 主要试剂  35-36
    3.1.5 培养方法  36
    3.1.6 发酵条件的优化  36
    3.1.7 脂肪酸的提取  36-37
    3.1.8 脂肪酸的甲酯化  37
    3.1.9 脂肪酸的检测  37
    3.1.10 发酵培养基的优化  37
  3.2 结果与讨论  37-45
    3.2.1 诱导条件的初步探讨  37-38
    3.2.2 碳源对CLA 产量的影响  38-39
    3.2.3 氮源对CLA 产量的影响  39
    3.2.4 接种量对CLA 产量的影响  39-40
    3.2.5 培养基初始pH 对CLA 产量的影响  40-41
    3.2.6 LA 添加量对CLA 产量的影响  41
    3.2.7 费氏丙酸杆菌费氏亚种转化亚油酸生成CLA 发酵优化  41-45
  3.3 本章小结  45-47
第四章全细胞有机相酶反应生成CLA  47-61
  4.1 材料与方法  47-50
    4.1.1 菌种  47
    4.1.2 培养基  47
    4.1.3 主要仪器设备  47-48
    4.1.4 主要试剂  48
    4.1.5 培养方法  48
    4.1.6 亚油酸异构酶细胞悬浮液的制备  48
    4.1.7 亚油酸异构酶细胞干粉的制备  48
    4.1.8 细胞干粉转化亚油酸生成CLA 的测定  48-49
    4.1.9 细胞干粉催化反应的单因素实验  49
    4.1.10 细胞干粉催化反应影响因素的正交实验  49
    4.1.11 亚油酸异构酶细胞固定化的制备  49-50
    4.1.12 固定化载体的选择  50
    4.1.13 脂肪酸的甲酯化  50
    4.1.14 脂肪酸的检测  50
  4.2 结果与讨论  50-59
    4.2.1 细胞干粉催化亚油酸生成CLA 气相分析  50-52
    4.2.2 有机溶剂对催化反应的影响  52
    4.2.3 体系含水量对催化反应的影响  52-53
    4.2.4 温度对催化反应的影响  53-54
    4.2.5 底物加量对催化反应的影响  54-55
    4.2.6 摇床转速对催化反应的影响  55
    4.2.7 细胞干粉转化亚油酸生成CLA 条件的优化  55-57
    4.2.8 有机相中酶的重复利用  57-58
    4.2.9 固定化载体的选择  58
    4.2.10 固定化细胞重复利用  58-59
  4.3 本章小结  59-61
第五章全文结论与展望  61-63
  5.1 结论  61-62
  5.2 创新点  62
  5.3 展望  62-63
参考文献  63-69
致谢  69-70
作者简介  70

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