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梅毒螺旋体膜脂蛋白Tp0663、Tp0821、Tp0971通过TLR2途径诱导巨噬细胞产生前炎症细胞因子

作　者: 张跃军
导　师: 吴移谋
学　校: 南华大学
专　业: 病原生物学
关键词: 梅毒螺旋体 膜脂蛋白 前炎症细胞因子 信号转导途径
分类号: R377
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的:探讨梅毒螺旋体(Treponema pallidum, Tp)膜脂蛋白Tp0663、Tp0821、Tp0971能否诱导巨噬细胞产生前炎症细胞因子(CKs)IL-6和IL-1β;通过观察TLR2抗体、CD14抗体、NF-κB特异抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)对三种膜脂蛋白诱导巨噬细胞产生CKs的影响,研究这些膜脂蛋白诱导产生前炎症CKs是否与TLR2、CD14及NF-κB介导的信号转导途径有关。方法:①通过Genbank获取选Tp0663、Tp0821和Tp0971的基因序列,以Tp Nichols株基因组DNA为模板,PCR扩增目的片段,将其亚克隆至原核表达载体pET28a(+)中构建重组质粒pET28a(+)/Tp0663、pET28a(+)/Tp0821和pET28a(+)/Tp0971,经PCR、双酶切、测序鉴定后将其转化至表达宿主菌E.coli Rosseta中,IPTG诱导表达。采用SDS-PAGE和Western blot分析和鉴定表达产物;Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白,BCA法测定蛋白浓度;Detoxi-Gel?内毒素去除胶去除重组蛋白中的内毒素,经鲎试剂测定内毒素含量。②佛波酯(PMA)诱导人单核细胞THP-1转化为巨噬细胞,用Tp0663、Tp0821和Tp0971重组蛋白刺激巨噬细胞,ELISA双抗体夹心法检测诱生其前炎症细胞因子IL-6和IL-1β的情况;用TLR2抗体、CD14抗体和PDTC预处理巨噬细胞后,用Tp0663、Tp0821和p0971重组蛋白分别刺激巨噬细胞,ELISA分析TLR2抗体、CD14抗体和PDTC对重组蛋白诱导巨噬细胞产生IL-6和IL-1β的影响。结果:构建的重组质粒经酶切和测序鉴定证实插入片段为目的基因,测序结果与Genbank上登录序列完全一致;SDS-PAGE结果显示,在IPTG诱导下,重组表达菌分别表达了一相对分子量(Mr)约为34kDa(Tp0663)和36 kDa(Tp0821),29 kDa(Tp0971)的重组蛋白,目的蛋白在菌体细胞内以可溶性和包涵体形式存在,经Ni-NTA亲和纯化后,纯度在95%以上,Western blot结果显示其与目的蛋白大小相符;内毒素去除胶处理重组蛋白,经鲎试剂检测内毒素小于0.04EU/mL;THP-1细胞经PMA刺激转化为巨噬细胞,不同浓度的重组蛋白(0.5μg/ml～10μg/ml)能明显诱导巨噬细胞产生IL-6和IL-1β;当重组蛋白浓度高于3μg/ml(Tp0663)和5μg/ml(Tp0821和Tp0971)时,IL-6和IL-1β产生的量无明显增加。TLR2抗体处理后,Tp0663, Tp0821和Tp0971诱导IL-6的产生量分别降至66.0%、64.0%和60.0%,IL-1β的产生量分别降至63.0%、62.0%和62.0%;经CD14抗体处理后, IL-6的产生量分别降至71.0%、73.0%和69.0%,IL-1β的产生量分别降至69.0%、70.0%和66.0%,经TLR2和CD14抗体联合处理后IL-6的产生量分别降至54.0%、55.0%和56.0%,IL-1β的产生量分别降至51.0%、50.0%和52.0%,NF-κB特异性抑制剂PDTC处理后IL-6和IL-1β的产生量分别降至20%以下,各处理组与对照组(同型抗体)比较(P<0.05)有明显差异。结论:1. Tp0663、Tp0821和Tp0971重组蛋白能诱导巨噬细胞产生前炎症CKs IL-6和IL-1β;2. Tp0663、Tp0821和Tp0971重组蛋白诱导巨噬细胞产生前炎症CKs与TLR2和CD14及NF-κB参与的信号转导通路有关。

全文目录


一 主要缩略语英文索引  4-6
二 中文摘要  6-8
三 英文摘要  8-10
四 论文正文  10-50
  1. 前言  10-12
  2. 实验材料  12-15
  3 实验方法  15-28
  4. 实验结果  28-46
  5. 讨论  46-49
  6. 结论  49-50
五 参考文献  50-55
六 附录  55-65
七 文献综述  65-70
八 发表论文  70-71
九 致谢  71

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学（病原细菌学、病原微生物学） > 螺旋体属
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