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巴尔通体菌体外药敏试验方法研究及耐药性分析

作　者: 宋秀平
导　师: 刘起勇
学　校: 中国疾病预防控制中心
专　业: 公共卫生
关键词: 巴尔通体药敏试验 MIC
分类号: R446.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

研究背景巴尔通体(Bartonella)是一属新发现的能引起动物及人类不同疾病的微生物,巴尔通体的广泛致病性,引起了医学界的关注及重视。目前,巴尔通体已包括22个种及3个亚种,其中已知至少9种可致人类疾病,主要是杆菌样(B. bacilliformis)、汉赛(B.henselae)、五日热(B. quintana)、伊丽莎白(B. elizabethae)、格雷范姆(B. grahamii)克氏(B. clarrdgeriae)及文氏巴尔通体伯格霍夫亚种(B. vinsonii subsp berkhoffii)、B. vinsoniisubsp arupensis巴尔通体。巴尔通体不仅是猫抓病(CSD)的主要病原,同时还与卡瑞恩病、心内膜炎、杆菌性血管瘤和慢性巴尔通体血症等疾病有关。另外,巴尔通体有时还会引起视网膜炎、脑炎、肾小球肾炎和肺炎等。在临床上以CSD较为多见。对于免疫功能正常的人,猫抓病通常可以自愈,但是对于免疫缺陷的人(特别是艾滋病人),感染会持续很长时间,甚至终生,而且经常出现临床症状的反复。由于广谱抗生素的广泛应用及新的致病菌不断出现,细菌耐药性已成为全球关注热点,合理使用抗生素是减少耐药菌株产生的前提,同时也是治疗感染成败关键,因此建立快速、准确的体外药敏试验方法,准确检测细菌对抗生素的敏感性,监测细菌耐药情况、指导临床正规用药非常必要。研究目的：建立并完善巴尔通体体外药敏试验方法——E test法(第二金标准)；将E test法与美国国家临床试验标准化委员会(CLSI)金标准琼脂稀释法进行比较,确定最佳的巴尔通体菌体外药敏试验方法(最佳细菌浓度、最佳培养基和孵育时间)；并采用该方法,检测巴尔通体菌不同宿主(猫、狗、猴、鼠)分离株对22种抗生素的敏感性及最低抑菌浓度(MIC),同时对耐药性进行分析,为指导临床用药和抗药性监测提供参考。研究方法：建立巴尔通体菌体外药敏试验方法——E test法,首先检测巴尔通体菌国际标准株(汉赛、格雷范姆)对22种抗生素的敏感性并确定最低抑菌浓度(MIC)：分别采用含5%羊血的巧克力培养基和胰酶大豆琼脂培养基进行试验,确定最佳培养基、采用不同的接种浓度进行接种,确定最佳接种浓度,分别于接种后7天、14天观察结果,确定最佳孵育时间。将该方法与美国国家临床试验标准化委员会(CLSI)金标准琼脂稀释法(金标准)进行比较,评价E test法的可靠性。采用已建立的E test法,检测巴尔通体菌不同宿主(猫、狗、猴、鼠)分离株对22种抗生素的敏感性及最低抑菌浓度(MIC)。研究结果：建立了巴尔通体菌体外药敏试验方法——E test法,确定含5%羊血的胰酶大豆琼脂培养基为最佳培养基、2.OMCF为最佳接种浓度,大多数巴尔通体菌7天为最佳孵育时间；个别生长特别缓慢的巴尔通体菌14天(杆菌样巴尔通体、克氏巴尔通体)为最佳孵育时间。通过与金标准琼脂稀释法(金标准)进行比较,采用Wilcoxon符号秩和检验,P>0.05,说明采用两种方法药敏结果基本一致,其差异没有统计学意义。可以采用Etest法替代琼脂稀释法,作为巴尔通体菌体外药敏检测方法,且E test法具有操作简便、可重复性强的特点,确定E test法为最佳巴尔通体菌体外药敏试验方法。采用该方法对其余6株巴尔通体菌国际标准株(克氏、杆菌样、伊丽莎白、五日热、B. doshiae、B. tribocorum)和26株不同宿主分离株进行检测,巴尔通体菌在体外对强力霉素、阿奇霉素、红霉素、克拉仙霉素、阿莫西林、苄星青霉素、妥布霉素、庆大霉素、奈替米星、头孢他啶、利福平、阿莫西林加克拉维酸钾复合物、头孢三嗪敏感。不同种的巴尔通体对同一种抗生素的MIC值的差异具有统计学意义。推荐汉赛巴尔通体(ATCC49882)作为巴尔通体菌体外药敏试验质控菌株。研究结论：本研究建立并完善了巴尔通体菌体外药敏试验方法,确定E test法为最佳巴尔通体体外药敏试验方法,并对不同宿主分离株进行了检测,获得了巴尔通体菌的一些体外药敏数据,为临床使用抗菌药物提供参考,为将来CLSI制订巴尔通体药敏标准提供-定的依据。

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中文摘要  8-10
ABSTRACT  10-13
第一部分巴尔通体菌体外药敏试验方法研究和耐药性分析  13-50
  前言  13-17
  1. 材料  17-19
    1.1 实验用菌株  17-18
    1.2 质量控制菌株  18
    1.3 试验用抗生素  18-19
      1.3.1 E test药敏试纸条  18-19
      1.3.2 琼脂稀释法用抗生素标准品  19
    1.4 主要仪器和试剂  19
    1.5 分析软件  19
  2 方法  19-22
    2.1 E test方法测定MIC  19-20
      2.1.1 实验菌株的复苏及传代培养  19
      2.1.2 质控菌株的复苏及传代  19
      2.1.3 E test药敏试纸条的准备  19-20
      2.1.4 药敏试验菌液制备  20
      2.1.5 E test方法操作程序  20
    2.2 琼脂稀释法测定MIC  20
      2.2.1 抗生素的配置  20
      2.2.2 培养基配置  20
      2.2.3 接种菌液的制备  20
      2.2.4 接种、培养、判读结果  20
    2.3 质量控制  20-22
  3 结果  22-40
    3.1 两种药敏方法测试  22-23
    3.2 两种培养基培养巴尔通体药敏结果比较  23-24
    3.3 细菌接种浓度的分析  24-28
    3.4 不同分离株(2.0MCF接种浓度)培养时间分析  28-33
    3.5 耐药性分析  33-40
      3.5.1 汉赛巴尔通体MIC值分析  33-34
        表3-14 汉赛巴尔通体MIC  33-34
      3.5.2 对文森巴尔通体的MIC值分析  34-35
      3.5.3 对五日热巴尔通体的MIC值进行比较  35
      3.5.4 对不同种巴尔通体的MIC50和MIC90值进行比较  35-38
      3.5.5 不同种巴尔通体各种抗生素MIC范围比较  38-40
  4. 讨论  40-45
    4.1 研究方法小结  40
    4.2 耐药性分析  40-42
      4.2.1 敏感的药物  40
      4.2.2 MIC90值较高的药物  40-41
      4.2.3 体外药敏结果与临床效果的比较分析  41
      4.2.4 推荐治疗药物:根据体外药敏试验结果  41-42
    4.3 E test试验的评价及影响因素  42-43
      4.3.1 E test试验的评价  42
      4.3.2 E test试验影响因素  42-43
    4.4 本研究意义  43-45
  5. 展望  45-46
  参考文献  46-50
第二部分发表文章  50-60
  海南省小型兽类巴尔通体的分离培养和序列分析  50-60
    前言  52-53
    1 材料和方法  53-55
      1.1 阳性对照菌株  53
      1.2 样本采集  53
      1.3 巴尔通体的分离培养  53
      1.4 染色镜检  53
      1.5 PCR检测  53-55
    2 结果  55-58
      2.1 动物捕获情况  55
      2.2 小型兽类血液标本巴尔通体分离培养结果  55
      2.3 染色镜检结果  55
      2.4 PCR检测鉴定结果  55-56
      2.5 核苷酸序列及相似性比较  56
      2.6 与其他种巴尔通体的系统关系  56-58
    3 讨论  58-59
    参考文献  59-60
附录:各种巴尔通体药敏结果分析  60-66
致谢  66

巴尔通体菌体外药敏试验方法研究及耐药性分析

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