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转基因番茄防龋疫苗安全性的初步研究

作　者: 白国辉
导　师: 刘建国；杨德琴；顾瑜
学　校: 遵义医学院
专　业: 口腔基础医学
关键词: 转基因番茄基因漂移安全性防龋疫苗变异链球菌龋病
分类号: R781.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的：观察外源性目的基因pacA-ctxB、pacP-ctxB及目的蛋白PAcA/CTB、PAcP/CTB在转基因番茄和非转基因植物中的表达,转基因番茄免疫动物后的毒性作用,初步分析转基因番茄防龋疫苗的生态安全性和对动物的安全性。方法：本研究包括三个部分实验一转基因番茄中外源目的基因和目的蛋白表达的检测提取转基因番茄总DNA, PCR筛选含外源基因pacA-ctxB、pacP-ctxB的转基因番茄植株；通过Western blot检测外源蛋白的表达情况；提取番茄果实总蛋白,用BCA试剂盒测定番茄果实总蛋白含量,并用ELISA法对外源目的蛋白含量进行测定。实验二转基因番茄的生态安全性检查1、外源基因随花粉漂移的检测：田间种植转基因番茄,距转基因植株的边缘0.5m、1m、3m、10m处种植非转基因对照番茄作为基因漂移的受体,开花期自由授粉,结果期在距离转基因番茄植株边缘0.5m、1m、3m、10m处,随机分别收取10株番茄果实,采集种子实验室培养,幼苗期采集叶片进行PCR检测。2、转基因植株根际土壤的检测：在转基因番茄植株根部的东、南、西、北方向各取一份土壤样本,提取土壤总DNA进行外源基因根系漂移的检测。3、转基因番茄目的基因拷贝数的检测：用本课题组前期构建的重组质粒pEAC10、pEPC10作为标准品,SYBR Green实时荧光定量PCR法对含外源基因pacA-ctxB、pacP-ctxB的转基因番茄植株的总基因组样本重复检测,取平均值作为目的基因拷贝数。实验三转基因番茄的动物安全性检查1、对大鼠的急性毒性实验(1)动物的选择、分组：wistar大鼠24只,雌雄各半,随机分为3组。A组：用含PAcA/CTB蛋白的转基因番茄汁免疫；B组：用含PAcP/CTB蛋白的转基因番茄汁免疫组；C组(对照组)：用非转基因的番茄汁免疫。(2)免疫方案：1日3次,按20g/kg(体重)剂量灌胃。(3)观察指标：①实验期间每2天测量动物体重。②记录毒性反应症状出现和消失的时间,死亡时间。③第7天处死全部动物,取心、肝、肾、脾、胸腺进行组织病理学检查。2、对大鼠的亚慢性毒性实验(1)动物的选择、分组：wistar大鼠72只,雌雄各半,随机分为6组。实验组A1：用含PAcA/CTB蛋白的转基因番茄汁以20g/kg(体重)剂量免疫；实验组A2：用含PAcA/CTB蛋白的转基因番茄汁以10g/kg(体重)剂量免疫；实验组B1：用含PAcP/CTB蛋白的转基因番茄汁以20g/kg(体重)剂量免疫；实验组B2：用含PAcP/CTB蛋白的转基因番茄汁以10g/kg(体重)剂量免疫；实验组C1：用非转基因的番茄汁以20g/kg(体重)剂量免疫；实验组C2：用非转基因的番茄汁以10g/kg(体重)剂量免疫；(2)免疫方案：连续灌胃30天每天定时灌胃。(3)观察指标：①实验期间每天测量动物体重。②严密观察动物行为活动、外观体征。③灌胃第30天后进行血液学、血生化和尿液检查。④取其心、肝、脾、肺、肾称重,计算脏器系数。⑤心、肝、脾、肺、肾进行组织病理学检查。3、致突变实验的检查3.1骨髓细胞微核实验：(1)动物的选择、分组：昆明小鼠42只,雌雄各半,随机分为7组。实验组A1：用含PAcA/CTB蛋白的转基因番茄汁以5g/kg(体重)剂量免疫；实验组A2：用含PAcA/CTB蛋白的转基因番茄汁以2g/kg(体重)剂量免疫；实验组B1：用含PAcP/CTB蛋白的转基因番茄汁以5g/kg(体重)剂量免疫；实验组B2：用含PAcP/CTB蛋白的转基因番茄汁以2g/kg(体重)剂量免疫；阴性对照组C1：用非转基因的番茄汁以5g/kg(体重)剂量免疫；阴性对照组C2：用非转基因的番茄汁以2g/kg(体重)剂量免疫；阳性对照组D：用100mg/(kg*d)环磷酰胺注射；(2)免疫方案：实验组和对照组连续灌胃4天,阳性对照组环磷酰胺腹腔注射,连续4天。第5天处死动物。(3)观察指标：制备小鼠骨髓片,显微镜下计数含微核的嗜多染红细胞数,取其平均值。计算微核率。3.2精子畸形实验：(1)动物的选择、分组：雄性昆明小鼠42只,随机分为7组,除阳性对照组D用20mg/(kg*d)环磷酰胺注射外,其他分组同骨髓细胞微核实验。(2)免疫方案：实验组和对照组连续灌胃5天,阳性对照组环磷酰胺腹腔注射,连续5天。首次给予受试物后的第35天处死动物。(3)观察指标：制备小鼠精子片,显微镜下计数畸形的精子,计算精子畸形率。4、一代生殖毒性实验(1)动物的选择、分组：SD大鼠60只,雌雄各半,随机分为3组。A组：用含PAcA/CTB蛋白的转基因番茄汁免疫；B组：用含PAcP/CTB蛋白的转基因番茄汁免疫；C组(对照组)：用非转基因的番茄汁免疫。(2)免疫方案：以1g/kg(体重)剂量,雄鼠持续灌胃8周后,雌鼠开始灌胃,持续2周后,雌雄大鼠按1：1同笼交配,交配期间继续灌胃,3周后将雄性处死,雌鼠继续灌胃直至子代出生后3周断乳为止。(3)观察指标：①每天观察大鼠的一般状况,每周称重。②每一妊娠动物在分娩后检查幼仔数、死产仔数、活产仔数。记录幼仔出生时及生后1、4、7、21天的体重、身长和尾长、并计数活、死幼仔数。③计算亲代大鼠的受孕率、正常分娩率,以及幼鼠的出生存活率和哺乳成活率。④观察胎鼠的骨骼软骨。⑤所有动物处死时进行肉眼病理学检查,必要时进行组织病理学检查。结果：1、含pacA-CtxB和pacP-ctxB的转基因番茄总基因进行PCR扩增检测,得到大小约为450bp和506bp的条带,与阳性对照一致。Western Blot检测转基因番茄蛋白提取样本在PVDF膜上约60KD处出现特异性条带。BCA法及ELISA法测得含PAcA/CTB转基因番茄外源目的蛋白约占植物总蛋白含量的0.101%,含PAcP/CTB转基因番茄外源目的蛋白约占植物总蛋白含量的0.068%。2、①距离转基因番茄0.5m处的17株非转基因番茄第二代植株进行PCR检测发现有外源目的基因pacA-ctxB、pacP-ctxB；②分别对10株含pacA-ctxB、pacP-ctxB转基因番茄的东、南、西、北四个方向根际土壤总DNA中未扩增出相应的目的片段；③本课题组培育的含pacA-ctxB转基因番茄植株外源基因的拷贝数为1.3,含pacP-ctxB转基因番茄植株外源基因的拷贝数为3.2。3、①急性毒性实验中大鼠均未见毒性症状,实验组大鼠各脏器与阴性对照组比较差异均无统计学意义,急性毒性半数致死量LD50>20g/kg；②亚慢性毒性实验中雌雄大鼠均未见毒性症状,通过血液学和生化、脏器系数和组织病理学检查,实验组大鼠与阴性对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)；③骨髓细胞微核实验中4个转基因番茄实验组小鼠骨髓细胞微核发生率与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)：而阳性对照组与其他各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)；精子畸形实验中4个转基因番茄实验组的受试小鼠的精子畸形率与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；而阳性对照组与其他各组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；④一代生殖毒性实验中,实验期间各组大鼠均未出现毒性症状,体重变化比较差异均无统计学意义(P>0.05)；各组仔鼠的平均体重、身长、尾长经两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)；实验组的受孕率、正常分娩率、幼仔出生存活率、幼仔哺乳成活率各指标与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)；实验组胎仔脊椎骨、胸骨、肋骨、四肢骨等检查与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)；经肉眼观察,各组动物心、肝、脾、肺、肾、子宫、卵巢、睾丸、附睾的大小、颜色、外形、软硬度及切面结构等均未见明显异常变化。结论：1、获得了含有pacA-ctxB和pacP-ctxB目的基因的转基因番茄植株,并且转基因番茄子代植株能有效的表达外源蛋白。2、外源基因pacA-ctxB、pacP-ctxB在田间可通过花粉造成基因漂移,但外源基因未通过根系分泌物漂移到转基因植株根际土壤中。本课题组构建的转基因番茄植株属低拷贝的转基因植物,具有较好的稳定性。3、本实验中转基因番茄防龋疫苗没有急性,亚慢性毒性作用,也不会引起致畸突变反应和明显的生殖毒性作用,初步证实所用的转基因番茄防龋疫苗是安全无毒的。

全文目录

1 转基因番茄防龋疫苗安全性的初步研究  5-66
  1.1 英汉缩略词对照表  5-6
  1.2 中文摘要  6-10
  1.3 英文摘要  10-14
  1.4 前言  14-16
  1.5 第一部分:转基因番茄中变异链球菌表面蛋白PAcA、PAcP与霍乱毒素B亚单位嵌合基因的检测及目的蛋白含量的测定  16-25
    材料和方法  16-19
    结果  19-22
    讨论  22-24
    结论  24-25
  1.6 第二部分:转基因番茄防龋疫苗生态安全性的初步研究  25-39
    实验一:转基因番茄基因漂移的检测  25-31
      材料和方法  25-26
      结果  26-29
      讨论  29-30
      结论  30-31
    实验二:转基因番茄外源基因拷贝数的检测  31-39
      材料和方法  31-33
      结果  33-37
      讨论  37-38
      结论  38-39
  1.7 第三部分:转基因番茄防龋疫苗动物安全性的研究  39-61
    实验一:转基因番茄对大鼠的急性毒性实验  39-43
      材料与方法  39-40
      结果  40-42
      讨论  42
      结论  42-43
    实验二:转基因番茄对大鼠的亚慢性毒性实验  43-50
      材料与方法  43-45
      结果  45-48
      讨论  48-49
      结论  49-50
    实验三:转基因番茄对小鼠的致突变检测  50-57
      材料与方法  50-52
      结果  52-55
      讨论  55-56
      结论  56-57
    实验四:转基因番茄的一代生殖毒性实验  57-61
      材料与方法  57-59
      结果  59-61
      结论  61
  1.8 全文总结  61-62
  1.9 参考文献  62-66
2 转基因植物功能蛋白表达的检测技术(综述)  66-73
  参考文献  71-73
3 致谢  73-74
附录  74

转基因番茄防龋疫苗安全性的初步研究

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