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新型去甲万古霉素—纤维蛋白胶磷酸钙人工骨研究

作　者: 张飞
导　师: 李奇
学　校: 南方医科大学
专　业: 骨外科学
关键词: 去甲万古霉素纤维蛋白胶磷酸钙生物材料
分类号: R318.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

研究背景：近年严重车祸伤、工作及高坠伤等高能量创伤发生率大大增加。其导致的严重开放性骨折脱位和软组织损伤发生率也相应增加,因伤者伤口污染与细菌残留引起的感染是骨科面临的一大难题,研制一种既能有效的填充骨缺损,又具有局部抗感染能力的生物材料。该生物材料应具有良好的生物相容性,可在体内自然降解,早期利于骨长入,并且还应至少具有松质骨以上机械强度等特点,本课题所研究的新型材料可能具备上述两种功能,是治疗感染性骨缺损的理想方法。目的与意义：通过对新型去甲万古霉素-纤维蛋白胶磷酸钙人工骨的理学特点、急性细胞毒性、抗溃散抗冲涮性及其内去甲万古霉素的体外释放规律研究,为探索研制既具有局部骨填充作用,又具有抗感染能力的新型生物材料提供相关实验依据。实验方法：1.新型去甲万古霉素-纤维蛋白胶磷酸钙人工骨的理学特性研究在人工骨固相粉末(β-磷酸三钙和磷酸二氢钙按3:1配比)中加入适量去甲万古霉素(norvancomycin下称NV)粉末,充分研磨混合,按固液比为1g：0.4ml加入500 mmol/L柠檬酸溶液,充分混均,同时以双腔推液器将预先配制好的纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液以相同体积推至上述人工骨膏体中,即制得含NV质量分数为4%的新型复合磷酸钙人工骨(对照组材料仅以β-磷酸三钙和磷酸二氢钙混合粉末1g:0.4ml与柠檬酸溶液混均)。分别将适量上述两种人工骨膏体充分混匀,填入内经6mm、高12mm的模具中,用水泥稠度凝结测定仪进行凝结时间的测试,以单针进入至1/2材料试样高度为限作为初凝时间,并以进入试样深度≦0.5mm为终凝时间。另取上述两组人工骨膏体填入内经为6mm,高18mm的标准钢模中,成形后即脱模并置于恒温恒湿箱中充分水化4周,抛光试样两端后以电子式万能材料试验机测试其抗压强度,以上固化时间、固化强度测试每组材料均重复6次。另取少许样本做X-线衍射检测其固化产物及扫描电镜观察,同时以排水法测试两组材料的的孔隙率。测得数据均经SPSS13.0软件包处理,并做两独立样本t检验其是否有差异。2.去甲万古霉素-纤维蛋白胶磷酸钙人工骨的急性细胞毒性和抗冲涮性能研究①急性细胞毒性试验：取适量按以上实验方法制得的两组人工骨材料试件,经钴-60γ射线照射灭菌后按30g/L投于一定量DMEM/F12基础培养液内浸提72h,去除试件并滤除浸提液内沉渣部分,按预定比例往浸提液内加入一定量胎牛血清,分别配成含10%胎牛血清的全培养液备用。另以普通正常DMEM/F12基础培养基配成10%胎牛血清的全培养液进行对比,每组设三个重复组。经颈椎脱臼法处死SD大鼠后在无菌条件下取其双侧股、胫骨骨髓液,并分别以上述制成的三组全细胞培养液冲洗骨髓腔,以全骨髓培养法培养贴壁细胞(主要为骨髓间充质干细胞),光学显微镜下观察待细胞融合至约85%-90%时以细胞计数板计数各组培养瓶内细胞数量级,并观察各时期细胞的形态变化,以此作为材料对细胞的急性毒性的初步评价指标。②材料的抗溃散性及抗冲涮性研究：用传统的浸泡法及模拟术中松质骨持续渗血两种方法测试材料的抗溃散性及抗冲涮性,后者作为一种改良测试材料的抗冲涮性方法,是骨水泥浆体注射后给予一定的动态冲涮力,并以达到终凝后剩余质量(m1)与初始质量(m2)的比值作为衡量其抗冲涮性能的指标,每组材料重复3次取均值。同时观察材料的表面形态和粗糙程度。3.去甲万古霉素-纤维蛋白胶磷酸钙人工骨中抗菌素的体外释放特点研究将标准NV溶液配成200mg/L, 100mg/L,50mg/L,25mg/L,12.5mg/L,6.25mg/L浓度梯度,以紫外分光光度计在室内温度条件下对200-800nm波长范围进行扫描,以出现最高峰值波长为检测波长进行实验,测量各浓度梯度去甲万古霉素溶液的OD值,结果经SPSS13.0软件包处理算得其标准回归方程并对其进行检验。取适量两组材料试件投于0.9%生理盐水中持续浸提,前10d每24h、之后每5d/次以洁净注射器抽取全部浸提液送OD值检测,将材料试件取出并置于另一洁净试管中,重新注入等量生理盐水继续浸提,依次类推直至浸提液内抗菌素浓度接近零,实验结束。根据上述得出的标准回归方程,计算出两组材料试件中抗菌素释放量与时间的关系。测量随时间(d)变化,两组材料浸提液OD值、去甲万古霉素药液浓度x(mg/L)及抗菌素累计释放量占总药量百分比P(%)变化情况,用SPSS13.0软件包作浸提天数(d)对每日浸提液OD值的分群金字塔图。实验结果：1.新型复合材料的理学特点：新型NV-FG-CPC材料的初凝、终凝时间均较单纯CPC组明显短缩,分别缩短1.08min和3.28min。随着FG及NV的掺入,新型人工骨的抗压强度明显下降,水化4周后,NV-FG-CPC组与单纯CPC组材料的抗压强度分别为6.43±1.09Mpa和14.72±3.38Mpa(统计检验t=5.710,P<0.01,)。前者的孔隙率较后者提高4个百分点,新型材料的主要固化产物仍为磷酸钙,扫描电镜观察可见FG将CPC晶体连接成片,且可见散在分布的,与背景颗粒不甚一致,大小约为3-6μm的抗菌素颗粒。2.材料的急性细胞毒性,抗溃散及抗冲涮性结果：各组培养瓶内原代细胞生长良好,培养约第14d三瓶细胞达到85%-90%融合率,此时各组培养瓶内细胞形态较一致,状态良好,大部分呈长梭形或短梭形,且三组细胞数目数量级均达106/L。单纯CPC组于生理盐水溶液内24h后即可见周围被云雾状带包绕,而NV-FG-CPC组周围未见此现象发生,仅见少量脱落的水泥小粒。3次重复实验NV-FG-CPC组见玻管内仍剩余大量骨水泥块,初始质量及达到终凝后质量均值分别为0.903g及0.750g,残余m1/m2=83.1%,冲涮面骨水泥表面较光滑,周围未见明显水泥小粒。而CPC组玻管内剩余的骨水泥量明显减少,冲涮面骨水泥粗糙不平,且见容器内大量被冲散的骨水泥小粒,以同样方法算得其m2=0.840g,ml=0.567g,ml/m2=67.5%。利用改良抗冲涮实验测得新型材料在动态状状下具有较更强的抗冲涮能力,结果与传统方法测得其抗溃散性一致。3.新型材料中去甲万古霉素的体外释放规律：标准NV溶液在室内25℃条件下于226nm波长处出现最大吸收峰,生理盐水中OD值随溶液浓度x(mg/L)的标准回归方程为：OD=0.013x+0.173(R2=0.971,调整R2=0.964,方程检验F=133.58,P=0.00,说明该方程有统计学意义,NV溶液OD值随其浓度变化趋势可以上述方程表示)。新型材料中去甲万霉素跟传统载药体系类似,先产生一次暴发性释放过程,此过程持续时间分别为4d和6d。之后NV-FG-CPC系统间隔2d后再次出现一次持续释放抗菌素的高峰期,时间约达8d,而CPC体系内药液浓度呈持续下降趋势。新型材料组中去甲万古霉素可维持释放时间至少达6周以上,而对照组大约在第4周时药液浓度急剧降至最低抗菌浓度以下,两组材料内去甲万古霉素总释放量分别在第30d、第15d达到总含量的90%以上主要结论：1.新研制的去甲万霉素-纤维蛋白胶磷酸钙人工骨具有良好的理学特性,其自固化时间及固化后的抗压强度均达人工骨的临床应用要求,具有较强的可操作性。新型材料固化后的主要产物仍为磷酸钙,且随着纤维蛋白胶的加入孔隙率有所提高,新型复合材料在电镜下可见抗菌素颗粒,表明去甲万古霉素颗粒成功复合到材料中。2.在传统型磷酸钙人工骨中同时复合去甲万古霉素、纤维蛋白胶后并未产生新的有毒物质,材料的急性细胞毒性实验显示其生物安全性良好,同时具备较强的抗冲涮性能。3.新研发的磷酸钙缓释系统中随着纤维蛋白胶的掺入,其持续释放时间明显延长,至少可达6周以上,较传统CPC组明显延长,且去甲万古霉素在浸提液中可维持足够的抑菌浓度。

新型去甲万古霉素—纤维蛋白胶磷酸钙人工骨研究

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