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马唐生防菌Col-68（Colletotrichum sp.）生物学特性研究及遗传改良

作　者: 陈娟
导　师: 孙国昌
学　校: 浙江师范大学
专　业: 植物学
关键词: 马唐炭疽病生物除草剂生物学特性遗传改良
分类号: S451
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

马唐是世界18种恶性杂草之一,目前的防治主要以化学除草剂为主。但是,随着化学除草剂的广泛应用,随之而来的环境污染、杂草耐药性提高等问题也日益加重。生物防治因其对环境友好和高度选择性等优点逐步成为研究热点。本实验室从马唐罹病叶片上分离得到炭疽病病原菌Col-68(Colletotrichum sp.),前期试验研究表明,该菌对马唐具有很强的致病力,但并不侵染水稻、棉花、玉米、大豆、小麦、花生等经济作物及主要草坪草,具有很高的生物安全性。为明确该菌的生理特性,更好的利用该菌开展生物防治,对其生物学特性进行了研究,并进行了遗传改良。生物学特性分析结果表明,菌丝体在15-35℃均可生长和产孢,在马唐汁培养基上生长最好,5天后菌落直径为8.01 cm,在PSA培养基上产孢最多,15天后产孢量可达5.55×106个/皿；该菌株最适生长和产孢的温度及初始pH值均为28℃和6.5,光照有利于产孢。分生孢子萌发最适温度为35℃,最适初始pH值为6.5,黑暗有利于孢子萌发；分生孢子温热致死温度和时间为53℃/10 min。通过不同液体培养基发酵培养,发现该菌在麸皮液体培养基中产孢最好,3天后产孢量可达106个/mL。综上所述,马唐致病真菌Col-68生长条件广泛,并且具备良好的发酵条件,已经具备了真菌除草剂候选菌株的基本条件,是马唐生防菌的潜力菌株。为了提高菌株Col-68的产孢量和生防效果,采用紫外诱变和根癌农杆菌介导转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, ATMT)的方法对菌株Col-68进行遗传改良。通过紫外诱变,从153个稳定的诱变菌株中筛选到产孢能力增强菌株1株(ZW84),其产孢量可达107个/皿;此外通过致病性测定,筛选到对马唐生防效果增强菌株6株(ZW8,ZW15,ZW17,ZW49,ZW61,ZW84),其中ZW84对马唐的防除效果最佳。通过农杆菌介导转化,经过潮霉素的二次筛选,共获得约200个稳定遗传的转化子,转化效率为平均每106个分生孢子可得到150-200个转化子。对随机挑取的转化子进行PCR检测、荧光观察和Southern杂交检测结果表明T-DNA已经成功插入到炭疽病菌的基因组中。通过生物学特性分析,筛选到产孢量增强菌株2株(ZH12和ZH18),其中ZH18的产孢量达到107个/皿。此外,致病性测定结果表明,ZH2,ZH16,ZH18,ZH22和ZH23这5株转化菌株的生防效果均比野生型高。将这11株突变菌株作为工业生产候选菌株,为进一步开发研究该菌成为工程菌和进行工业化生产打下基础。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
缩略词  10-12
目录  12-17
第一部分文献综述  17-32
  第一章微生物除草剂的研究进展  17-25
    1 活体微生物除草剂的研究进展  17-21
      1.1 真菌除草剂的研究进展  17-20
      1.2 细菌及病毒微生物除草剂的研究进展  20-21
    2 农用抗生素除草剂的研究进展  21-22
    3 杂草生物防治的局限性  22-23
      3.1 寄主单一性的限制  22-23
      3.2 环境因子及制剂的影响  23
      3.3 菌种退化,工业化生产难  23
    4 马唐生防菌的研究进展  23-25
  第二章菌种遗传改良的研究进展  25-31
    1 诱变技术在菌种改良中的应用  25-28
      1.1 化学诱变  25-26
      1.2 物理诱变  26-28
    2 生物技术在菌种改良中的应用  28-31
      2.1 原生质体转化  28-29
      2.2 电转化法  29
      2.3 限制性内切酶介导整合技术  29-30
      2.4 农杆菌介导的转化(ATMT)  30-31
  第三章本课题研究目的及意义  31-32
第二部分研究内容  32-56
  第一章马唐生防菌Col-68(Colletotrichum sp.)生物学特性  32-40
    1 前言  32-33
    2 材料与方法  33-35
      2.1 材料  33
      2.2 不同环境因子对菌株Col-68菌丝生长及产孢的影响  33-34
      2.3 不同环境因子对菌株Col-68分生孢子萌发试验  34-35
      2.4 菌株Col-68液体发酵培养基的选择  35
      2.5 数据统计与分析  35
    3 结果与分析  35-38
    4 讨论  38-40
  第二章马唐生防菌Col-68(Colletotrichum sp.)紫外诱变改良  40-47
    1 前言  40
    2 材料与方法  40-42
      2.1 材料和试剂  40-41
      2.2 孢子悬浮液的配制  41
      2.3 紫外辐射敏感性测试  41
      2.4 紫外诱变处理  41
      2.5 诱变突变体保存  41-42
      2.6 对诱变突变体生物学性状分析  42
    3 结果与分析  42-46
      3.1 菌株对紫外辐射的敏感性测试结果  42-43
      3.2 紫外诱变处理菌株Col-68试验结果  43
      3.3 对诱变菌株生物学性状分析结果  43-46
    4 讨论  46-47
  第三章农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的马唐生防菌Col-68(Colletotrichum sp.)转化及致病突变体筛选  47-56
    1 前言  47
    2 材料与方法  47-50
      2.1 供试菌株、质粒与培养条件  47-48
      2.2 培养基的配制  48
      2.3 载体构建与引物设计  48
      2.4 农杆菌的冻融法转化  48
      2.5 马唐炭疽病菌菌株Col-68的T-DNA转化  48-49
      2.6 菌株Col-68的DNA提取与转化子的检测  49-50
      2.7 转化子的生物学特性分析  50
    3 结果与分析  50-54
      3.1 马唐炭疽病病菌转化子的获得  50
      3.2 转化子的检测  50-52
      3.3 转化子生物学性状分析结果  52-54
    4 讨论  54-56
参考文献  56-63
附录A  63-65
  1 质粒pBIG2RHPH2-GFP-GUS  63
  2 菌株Col-68潮霉素敏感性测定  63-64
  3 ATMT转化子潮霉素二次筛选  64-65
附录B 马唐种子消毒与催芽  65-66
附录C 常规分子生物学实验技术  66-74
  1 真菌DNA提取(CTAB法)  66
  2 农杆菌冻融法转化  66-67
  3 PCR反应  67-68
    3.1 PCR体系  67
    3.2 PCR反应  67-68
  4 Southern杂交酶切反应体系  68
  5 DNA的琼脂糖电泳  68
  6 DNA片段的凝胶回收  68-69
  7 Southern杂交分析  69-74
    7.1 试剂的配制  69-70
    7.2 DIG-DNA探针标记  70
    7.3 马唐炭疽病菌Col-68基因组DNA的消化、电泳及变性  70-71
    7.4 DNA转膜  71-72
    7.5 Southern杂交过程  72-73
    7.6 免疫显色  73-74
攻读学位期间取得的研究成果  74-75
致谢  75-76

马唐生防菌Col-68（Colletotrichum sp.）生物学特性研究及遗传改良

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