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柚（Citrus grandis （L.）Osbeck）单染色体AFLP特异分子标记体系的构建

作　者: 柳燕贞
导　师: 陈伟；王平
学　校: 福建农林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 柚单染色体显微分离分子标记 AFLP Southern杂交
分类号: S666.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 29次
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内容摘要

柚是柑橘属重要的水果之一,然而由于柚遗传背景较复杂,生产周期长,一直以来难以建立精确的物理图谱,这为进行柚基因组学的研究、分子标记辅助育种以及克隆一些重要的园艺性状基因造成了困难。如果能定向获得某一条染色体的一些特异分子标记,建立一个识别各单染色体的分子标记体系,相应就能构建整套的柚单染色体文库,将会大大提高柚遗传图谱绘制的工作效率。本研究以此为依据,运用AFLP分子标记技术筛选琯溪蜜柚单染色体特异分子标记,并取得了如下结果:1、本试验以琯溪蜜柚幼胚作为材料,采用玻璃针法显微分离出56条单染色体。通过酶切、接头连接、两轮LA-PCR扩增,建立了56条单染色体文库。经1%琼脂糖凝胶电泳分析,不同单染色体扩增产物的分布有所差异,主要分布在300～2000 bp之间。2、设计引物组合42对,筛选出L/X和F/I两对引物,对56条单染色体进行AFLP分析,得到清晰的AFLP图谱。经UPGMA聚类分析表明,当相似系数为0.76时,初步将56条单染色体分为11类。3、通过AFLP多态性分析,筛选出了361条差异片段。选取其中的129条差异片段进行Southern杂交分析,共获得了32个单染色体AFLP特异分子标记。根据特异分子标记在各单染色体中的分布情况,可以明确将56条单染色体中的22条分为九类。4、测定11个单染色体特异分子标记的序列,经NCBI数据库中的BLAST比对,其中有8个特异分子标记与植物具有较高的同源性,包含3个柑橘属柑橘抗腐根病病毒(CTV)基因,和1个LINE反转录转座子。本试验通过建立AFLP图谱,对差异片段进行Southern杂交筛选分析,初步构建了柚单染色体AFLP特异分子标记体系。这为进一步建立覆盖率高的全套单染色体文库、定位基因和构建连锁图谱奠定了基础。

全文目录

摘要  8-9
ABSTRACT  9-12
1 文献综述  12-21
  1.1 染色体微分离及微克隆技术概述  12-14
    1.1.1 染色体微分离及微克隆技术研究进展  12-13
    1.1.2 染色体微分离及微克隆技术在植物上的研究  13-14
    1.1.3 染色体微分离和微克隆在柚类中的研究  14
  1.2 AFLP 分子标记技术在植物中的研究进展  14-19
    1.2.1 AFLP 分子标记基本原理和技术流程  15-16
    1.2.2 AFLP 分子标记在植物研究中的应用  16-18
      1.2.2.1 植物遗传多样性的分析  16-17
      1.2.2.2 遗传图谱的构建  17
      1.2.2.3 基因定位与数量性状位点（QTLS）分析  17-18
    1.2.3 AFLP 分子标记技术在柚类中的应用  18-19
  1.3 研究目的意义与试验设计  19-21
    1.3.1 研究目的意义  19-20
    1.3.2 试验设计及技术路线  20-21
2 材料与方法  21-37
  2.1 主要仪器设备和生化试剂  21-23
    2.1.1 仪器设备  21-22
    2.1.2 生化试剂  22-23
  2.2 试验材料  23
  2.3 试验方法与步骤  23-37
    2.3.1 琯溪蜜柚基因组DNA 的提取  23-25
      2.3.1.1 DNA 的提取步骤  23-24
      2.3.1.2 基因组DNA 质量检测  24
      2.3.1.3 基因组DNA 的酶切及纯化  24-25
    2.3.2 染色体标本的制备  25
    2.3.3 单染色体的微分离  25-26
      2.3.3.1 玻璃针的制备  25
      2.3.3.2 显微分离  25-26
    2.3.4 单染色体的体外扩增  26-28
      2.3.4.1 蛋白酶K 消化  26
      2.3.4.2 LA-PCR  26-28
    2.3.5 单染色体AFLP 分析  28-31
      2.3.5.1 选择性扩增  28-30
      2.3.5.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳  30-31
    2.3.6 单染色体聚类分析  31-32
    2.3.7 单染色体AFLP 差异片段的回收、纯化  32-33
      2.3.7.1 差异片段的回收  32
      2.3.7.2 差异片段的二次扩增  32
      2.3.7.3 二次扩增产物的纯化  32-33
    2.3.8 Southern 杂交筛选验证特异分子标记  33-35
      2.3.8.1 探针制备  33
      2.3.8.2 估计探针效率  33-34
      2.3.8.3 Southern 杂交  34-35
      2.3.8.4 显色反应  35
    2.3.9 单染色体特异分子标记的克隆及测序  35-37
      2.3.9.1 感受态细胞的制备  35-36
      2.3.9.2 连接载体  36
      2.3.9.3 连接产物的转化  36
      2.3.9.4 菌落PCR 检测  36
      2.3.9.5 序列测定与分析  36-37
3 结果与分析  37-60
  3.1 柚基因组DNA 的提取及酶切  37
  3.2 柚染色体制片、单染色体微分离与体外扩增  37-40
    3.2.1 柚染色体制片  37-38
    3.2.2 柚单染色体微分离  38
    3.2.3 单染色体体外扩增  38-40
    3.2.4 柚单染色体文库SOUTHERN 杂交验证  40
  3.3 柚单染色体AFLP 图谱的构建及初分类  40-48
    3.3.1 选择性扩增模板稀释倍数的确定  40-41
    3.3.2 引物的筛选  41-42
    3.3.3 选择性扩增  42-44
    3.3.4 AFLP 图谱分析  44-47
    3.3.5 聚类分析对琯溪蜜柚单染色体初步分类  47-48
  3.4 柚单染色体分子标记体系的构建  48-55
    3.4.1 单染色体差异片段的筛选  48
    3.4.2 差异片段的回收纯化  48-50
    3.4.3 SOUTHERN 杂交筛选柚单染色体特异分子标记  50-55
      3.4.3.1 差异片段来源真实性鉴定  50
      3.4.3.2 柚单染色体特异分子标记的筛选  50-55
  3.5 柚单染色体再分类分析  55
  3.6 单染色体特异分子标记序列分析  55-60
4 讨论  60-66
  4.1 柚基因组DNA 的提取  60
  4.2 柚高质量染色体标本的制备  60-61
  4.3 柚单染色体显微分离的关键问题  61
  4.4 柚单染色体的体外扩增及污染问题  61-62
    4.4.1 单染色体体外扩增  61-62
    4.4.2 单染色体体外DNA 体外扩增的污染问题  62
  4.5 柚单染色体的分类分析  62-63
  4.6 柚单染色体特异分子标记体系的构建  63-66
    4.6.1 特异分子标记的筛选验证  63-64
    4.6.2 特异分子标记的功能分析  64-66
5 结论  66-67
参考文献  67-77
致谢  77

柚（Citrus grandis （L.）Osbeck）单染色体AFLP特异分子标记体系的构建

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