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耻垢分枝杆菌ercc3基因相互作用蛋白的串联亲和纯化

作　者: 郑嘉熙
导　师: 汪世华
学　校: 福建农林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 耻构分枝杆菌 XPB/ercc3 串联亲和纯化蛋白相互作用转录起始
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

XPB/Ercc3是真核生物中TFIIH复合体的一个亚基,编码一个3’→5’方向的解螺旋酶,具有ATP依赖性的3’→5’helicase活性和ssDNA依赖性的ATPase活性。XPB作为TFIIH的一个组分参与转录起始与核苷酸切除修复（NER）,分别负责转录泡的打开与包含损伤位点的内切片段的移除。XPB作为细胞内关键途径的感受器和效应器还参与了细胞周期的调控和其他调控途径。在分枝杆菌属的原核生物中,通过同源比对发现了ercc3基因的同源编码序列,但未发现在真核中与ercc3相互作用并共同行使功能的那些基因的同源序列。并且,分枝杆菌有其自有的转录起始机器和核苷酸切除修复系统。因此,ercc3在分枝杆菌中的功能就成为一个需要阐明的问题。本文利用基于噬菌体基因的分枝杆菌重组工程系统,将串联亲和标签protein A-TEV protease site-calmodulin binding protein（TAP tag）定点敲入至耻垢分枝杆菌的ercc3基因表达框C末端,使带有TAP标签的Ercc3蛋白在基因组天然启动子的调控下表达,其表达量,定位与调控水平都和野生型ercc3基因一样。然后我们利用标签与两种不同亲和配体的结合作用,经过两次亲和纯化分离细胞裂解液中的Ercc3蛋白。由于整个纯化过程在温和条件下进行,与Ercc3蛋白相互作用的蛋白也被一起纯化出来。纯化组分经过跑SDS-PAGE分离,银染染色后,切下特异性的条带,trypsin酶解后打质谱分析。从质谱结果中我们得到了一系列蛋白,我们选择了其中的DNA依赖性RNA聚合酶β’亚基RpoC和β亚基RpoB,以及同源重组蛋白RecA进一步研究。经过farwestern和SBP pull-down验证,我们发现Ercc3与RNA聚合酶β’亚基RpoC在体外有直接的相互作用。在与实验室其他成员的合作中发现,Ercc3蛋白还与预测为DNA repair related ATPase的ATP依赖性的DNA结合蛋白ATPase,和预测为转录因子的共操纵子邻近基因MSMEG₅705有相互作用。但ercc3基因的敲除尚未发现明显的表型。根据以上结果,我们推测, ercc3基因可能与其相互作用蛋白共同参与耻构分枝杆菌的转录起始,并且很可能是介导耻垢分枝杆菌,以及结核分枝杆菌在特殊生存状态下的转录调控。

全文目录

摘要  7-8
ABSTRACT  8-9
1 引言  9-24
  1.1 真核转录因子TFIIH 及其亚基XPB  9-15
    1.1.1 解旋酶XPB 是多亚基通用转录因子TFIIH 的组分  9-10
    1.1.2 XPB 参与转录和修复  10-12
    1.1.3 XPB 参与细胞周期调控与凋亡控制  12-14
    1.1.4 XPB 参与的其他途径  14
    1.1.5 XPB 突变相关疾病  14-15
  1.2 分枝杆菌的转录起始和核苷酸切除修复(NER)  15-17
    1.2.1 分枝杆菌的转录起始  15-16
    1.2.2 分枝杆菌的核苷酸切除修复  16-17
  1.3 原核生物中存在XPB 的同源蛋白  17-19
    1.3.1 分枝杆菌中存在真核XPB 的同源蛋白Ercc3  18
    1.3.2 古细菌中ercc3 基因的研究进展  18-19
  1.4 串联亲和纯化在研究蛋白相互作用中的应用  19-24
    1.4.1 TAP 的原理和方法  19-22
    1.4.2 重组工程系统(Recombineering system)  22-24
2 材料与方法  24-41
  2.1 实验材料  24-28
    2.1.1 菌株，质粒和DNA 序列  24
    2.1.2 培养基  24-25
    2.1.3 试剂  25-26
    2.1.4 溶液及缓冲液  26-27
    2.1.5 实验仪器  27-28
  2.2 实验方法  28-41
    2.2.1 大肠杆菌的转化  28
    2.2.2 耻垢分枝杆菌基因组的提取  28
    2.2.3 大肠杆菌质粒的提取  28
    2.2.4 PCR 扩增M.smegmatis ercc3 终止密码子上，下游片段，TAP 标签及潮霉素抗性基因  28-30
    2.2.5 knock-in 载体的构建及knock-in DNA 片段的获得  30
    2.2.6 耻构分枝杆菌的电转化  30-32
    2.2.7 PCR 验证M.smegmatis mc2 155 ercc3-tap 重组子  32-34
    2.2.8 westernblot 验证Ercc3-TAP 表达  34
    2.2.9 串联亲和层析纯化Ercc3 蛋白  34-35
    2.2.10 蛋白浓缩  35
    2.2.11 蛋白银染  35
    2.2.12 质谱鉴定  35
    2.2.13 PCR 扩增 M.smegmatis rpoC 和 rpoB 基因,link-SBP 标签序列  35-37
    2.2.14 M.smegmatis RpoC, Ercc3-SBP, His-T7-SBP 表达载体的构建  37
    2.2.15 蛋白质的诱导生成  37
    2.2.16 蛋白质的大量表达与纯化  37-39
    2.2.17 SDS-PAGE 分析蛋白纯度及分子量  39
    2.2.18 蛋白质的浓度测定  39
    2.2.19 Far western 分析蛋白之间的相互作用  39
    2.2.20 SBP pull-down 分析蛋白之间的相互作用  39-41
3 结果与分析  41-50
  3.1 在基因组上ercc3 基因的C 端敲入TAP-tag 片段  41-42
  3.2 western blot 验证连有TAP-tag 标签的Ercc3 蛋白的表达情况  42
  3.3 串联亲和纯化Ercc3 蛋白  42-43
  3.4 质谱鉴定  43-45
  3.5 ercc3-sbp，rpoC，rpoB 等基因的克隆和蛋白的表达与纯化  45-47
  3.6 Far western 与SBP pull-down 分析Ercc3 与RpoC 间的相互作用  47-49
  3.7 Ercc3 与ATPase 和MSMEG_5705 间的相互作用  49-50
4 讨论  50-53
参考文献  53-56
致谢  56

耻垢分枝杆菌ercc3基因相互作用蛋白的串联亲和纯化

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