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BADH启动子驱动BADH基因在烟草中的表达

作　者: 朱丽萍
导　师: 李秋莉
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: BADH基因 盐胁迫 盐诱导启动子 甜菜碱
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


甜菜碱醛脱氢酶(BADH)是植物体内合成甜菜碱过程中的关键酶。甜菜碱是一种小分子、非毒性的渗透调节物质,在植物耐盐中起着重要的作用。BADH基因受盐诱导表达,其表达与其启动子(pB:-300 ~ +62bp)有关。pB是盐诱导表达启动子,在400mmol/L NaCl胁迫诱导时,其驱动的GUS活性是未经NaCl诱导时的6.3倍。本论文构建了辽宁碱蓬pB启动子驱动BADH基因的植物表达载体,转化到农杆菌中构建工程菌,利用农杆菌介导的叶盘转化法分别将pB-BADH和CaMV 35S-BADH转入烟草中。对两种类型的转基因烟草中BADH基因表达和甜菜碱含量进行分析。主要结果如下:1.通过PCR技术从克隆载体pMD18-T-BADH中扩增出约1.5kb的BADH基因编码区,通过酶切、连接,替代原表达载体pCAMBIA1301-pB-GUS中的GUS报告基因获得新的表达载体pCAMBIA1301-pB-BADH,并通过冻融法导入大肠杆菌DH5α,得到了E.coli.pCAMBIA1301- pB-BADH;2.将构建好的表达载体通过冻融法导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404中,获得工程菌LBA4404- pCAMBIA 1301- pB-BADH;3.采用农杆菌介导的叶盘转化法将pB-BADH和CaMV 35S -BADH转入烟草。PCR检测获得了阳性植株。半定量RT-PCR检测表明,转CaMV35S-BADH烟草中BADH基因的表达量明显高于转pB-BADH烟草;甜菜碱含量测定表明,转pB-BADH烟草甜菜碱的含量与野生烟草的甜菜碱含量相当,转CaMV35S-BADH烟草的甜菜碱含量普遍高于转pB-BADH烟草。4. 0.1mol/L NaCl处理转基因及对照烟草24 h后,半定量RT-PCR检测表明,转pB-BADH烟草的BADH表达量明显高于转CaMV35S-BADH烟草;甜菜碱含量测定表明,转pB-BADH烟草甜菜碱的含量较无处理时明显增加,并且高于野生烟草和转CaMV35S-BADH烟草。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-9
1 绪论  9-20
  1.1 植物启动子的结构及功能  9-11
    1.1.1 转录起始位点  9
    1.1.2 TATA 盒  9-10
    1.1.3 起始因子（Inr）  10
    1.1.4 顺式作用元件  10-11
  1.2 植物启动子的类型及应用  11-13
    1.2.1 组成型启动子  11-12
    1.2.2 组织特异型启动子  12
    1.2.3 诱导型启动子  12-13
  1.3 植物逆境诱导启动子及应用  13-17
    1.3.1 缺水诱导的启动子  13-14
    1.3.2 低温诱导启动子  14-15
    1.3.3 盐诱导的启动子  15-16
    1.3.4 受病原物诱导的启动子  16-17
  1.4 BADH 基因及其启动子  17-18
    1.4.1 BADH 基因  17-18
    1.4.2 BADH 基因启动子  18
  1.5 本研究的目的和意义  18-20
2 pB-BADH 植物表达载体构建  20-31
  2.1 试验材料  20-21
  2.2 实验方法  21-26
    2.2.1 外源基因的获得  21-24
    2.2.2 植物载体大片段的获得  24-25
    2.2.3 pB-BADH 植物表达载体的构建  25-26
  2.3 结果分析  26-30
    2.3.1 BADH 基因与载体大片段的获得  26-28
    2.3.2 pB-BADH 植物表达载体的构建  28-30
  2.4 小结  30-31
3 烟草转化及转基因烟草检测  31-45
  3.1 实验材料  31-32
  3.2 实验方法  32-38
    3.2.1 植物表达载体转化根癌农杆菌  32-33
    3.2.2 根癌农杆菌介导转化烟草转化及抗性芽的筛选  33-34
    3.2.3 转基因烟草的检测  34-38
      3.2.3.1 转基因烟草的PCR 检测  34-35
      3.2.3.2 转基因烟草的RT-PCR 检测  35-37
      3.2.3.3 甜菜碱含量的测定  37-38
  3.3 结果与分析  38-44
    3.3.1 工程菌的构建及检测  38-39
    3.3.2 烟草转化  39-40
    3.3.3 转基因烟草的检测  40-44
      3.3.3.1 转基因烟草的PCR 检测  40-41
      3.3.3.2 转基因烟草的RT-PCR 检测  41-42
      3.3.3.3 甜菜碱含量的测定  42-44
  3.4 小结  44-45
4 盐处理条件下BADH 基因在转基因烟草中的表达  45-50
  4.1 实验材料  45
  4.2 实验方法  45-46
    4.2.1 野生型烟草及两种转基因烟草的预处理  45
    4.2.2 野生型烟草及两种转基因烟草的盐处理  45
    4.2.3 盐处理后BADH 基因烟草的检测  45-46
    4.2.4 盐处理后转基因烟草甜菜碱含量的检测  46
  4.3 实验结果  46-49
    4.3.1 盐处理后烟草的生长状态  46-47
    4.3.2 盐诱导后转基因烟草的检测  47-49
      4.3.2.1 盐诱导后BADH 基因的表达  47-48
      4.3.2.2 盐诱导后转基因烟草中甜菜碱的含量  48-49
  4.4 讨论  49
  4.5 小结  49-50
5 结论与展望  50-52
  5.1 主要结论  50
  5.2 有待于进一步开展的工作  50
  5.3 展望  50-52
参考文献  52-57
附录A 培养基  57-59
附录B DNA Markers  59-60
附录C BADH 基因序列  60-61
附录D BADH 基因启动子序列  61-62
附录E 质粒图谱  62-63
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  63-64
致谢  64

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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