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结核分枝杆菌DNA拓扑异构酶Ⅰ与DNA的相互作用研究

作　者: 玉王宁
导　师: 喻子牛；黄友谊
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 结核分枝杆菌 DNA拓扑异构酶Ⅰ 蛋白质与DNA相互作用
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 37次
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内容摘要


DNA拓扑异构酶Ⅰ(DNA topoisomeraseⅠ, EC 5.99.1.2)是生物细胞存活所必须的基础酶类,属于类型Ⅰ拓扑异构酶。它能够使一条DNA单链通过另一条瞬时断裂的DNA单链,随后连接断裂的DNA,从而实现DNA拓扑结构的相互转化,此过程不需要能量辅因子,如ATP或NAD。但是目前国内外对拓扑异构酶Ⅰ的作用机理的研究还不是很深入。因为该酶进行催化反应的第一步就是与DNA结合,所以我们从对结核分枝杆菌拓扑异构酶Ⅰ(MTB TopoⅠ)与DNA的相互作用的研究为切入点展开了对MTB TopoⅠ的DNA结合机理的研究。通过一系列的实验研究发现：MTBTopoⅠ既能够结合双链DNA,也能够结合单链DNA,为一种单双链结合蛋白；MTBTopoⅠ既能够结合含有强拓扑异构酶结合位点(STS)序列的DNA片段,也能结合不含有STS序列的DNA片段,也就是说MTB TopoⅠ对DNA的结合没有序列特异性。我们通过对各种条件下它与DNA的结合情况的实验研究发现：MTB TopoⅠ结合双链DNA具有瞬时性,耐高温性,且不依赖于镁离子,比较适应于中性偏酸的环境条件等特点。在此基础上我们又对MTB TopoⅠ与大肠杆菌的TopoⅠ、大肠杆菌TopoⅢ与DNA的结合活性进行了比较。结果显示,MTB TopoⅠ较之其他两种类型Ⅰ拓扑异构酶蛋白有更强的DNA结合活性,而且用凝胶排阻电泳法检测到MTB TopoⅠ可以与酵母tRNA结合,从而推测MTB TopoⅠ可能是一种RNA结合蛋白。本研究结论,均说明该酶具有比较独特的DNA结合性质,有可能在DNA复制、转录以及染色体的浓缩重组等方面起着奇特的不可替代的作用。这些研究结论也将有利于了解MTB TopoⅠ催化DNA拓扑结构改变的作用机制,阐述MTB TopoⅠ的DNA结合机理,从而可以进一步探索生命活动的基本规律和MTB生长的调控机制,为发现有效的新型药物靶标和抗耐药结核分枝杆菌新药的设计和筛选提供新的思路,从而促进对结核病的防治。

全文目录


摘要  7-8
ABSTRACT  8-9
缩略语索引  9-10
1 DNA拓扑异构酶Ⅰ的研究进展  10-18
  1.1 DNA拓扑异构酶的分类与功能  10-11
    1.1.1 DNA拓扑异构酶的分类  10-11
    1.1.2 DNA拓扑异构酶的功能  11
  1.2 DNA拓扑异构酶的结构及其作用机制  11-13
  1.3 DNA拓扑异构酶Ⅰ的分类与功能  13-15
    1.3.1 Topo ⅠA  14
    1.3.2 Topo ⅠB  14
    1.3.3 Topo ⅠC  14-15
  1.4 DNA Topo Ⅰ的活性  15-16
    1.4.1 DNA Topo Ⅰ主要催化瞬时单链的断裂和连接  15
    1.4.2 DNA Topo Ⅰ作用不需要能量供应  15
    1.4.3 DNA Topo Ⅰ作用的碱基特异性情况  15-16
    1.4.4 DNA Topo Ⅰ的其他活性  16
  1.5 DNA拓扑异构酶Ⅰ抑制剂  16
  1.6 研究目的与意义  16-18
2 材料与方法  18-28
  2.1 试验材料  18-21
    2.1.1 培养基  18
    2.1.2 质粒与菌株  18-19
    2.1.3 各种分子生物学酶、试剂盒及常用试剂  19
    2.1.4 SDS-PAGE电泳用溶液及缓冲液  19-20
    2.1.5 实验仪器  20-21
  2.2 实验方法  21-28
    2.2.1 蛋白质的诱导表达与纯化  21
    2.2.2 蛋白质的亲和层析纯化  21-23
    2.2.3 用SDS-PAGE分析蛋白纯度及分子量  23-24
    2.2.4 蛋白质的浓度测定  24
    2.2.5 结核分枝杆菌Topo Ⅰ的蛋白表达与纯化  24
    2.2.6 大肠杆菌Topo Ⅰ的蛋白表达与纯化  24-25
    2.2.7 大肠杆菌Topo Ⅲ的蛋白表达与纯化  25
    2.2.8 结核分枝杆菌Topo Ⅰ松弛活性的测定  25
    2.2.9 结核分枝杆菌Topo Ⅰ的双链DNA(STS)结合活性的测定  25-26
    2.2.10 结核分枝杆菌Topo Ⅰ的双链DNA(无STS)结合活性的测定  26-27
    2.2.11 结核分枝杆菌Topo Ⅰ的单链DNA结合活性的测定  27
    2.2.12 结核分枝杆菌Topo Ⅰ的RNA结合活性的测定  27
    2.2.13 大肠杆菌Topo Ⅰ的双链DNA结合活性的测定  27
    2.2.14 大肠杆菌Topo Ⅲ的双链DNA结合活性的测定  27-28
3 结果与分析  28-44
  3.1 不同环境因素对结核分枝杆菌Topo Ⅰ的松弛活性的影响  28-33
    3.1.1 几种反应条件对结核分枝杆菌Topo Ⅰ松弛活性的影响  28-30
    3.1.2 离子条件对结核分枝杆菌Topo Ⅰ松弛活性的影响  30-32
    3.1.3 抑制剂EDTA对结核分枝杆菌Topo Ⅰ松弛超螺旋DNA的影响  32-33
  3.2 不同条件对结核分枝杆菌Topo Ⅰ与双链DNA相互作用的影响  33-39
    3.2.1 几种结合条件对结核分枝杆菌Topo Ⅰ结合双链DNA的影响  33-36
    3.2.2 离子条件对结核分枝杆菌Topo Ⅰ结合双链DNA的影响  36-38
    3.2.3 抑制剂EDTA对结核分枝杆菌Topo Ⅰ结合双链DNA的影响  38-39
  3.3 不同条件对结核分枝杆菌Topo Ⅰ与单链DNA相互作用的影响  39-40
  3.4 结核分枝杆菌Topo Ⅰ与RNA的相互作用  40-41
  3.5 结核分枝杆菌Topo Ⅰ、大肠杆菌Topo Ⅰ、大肠杆菌Topo Ⅲ三种蛋白的DNA结合活性比较  41-44
    3.5.1 三种蛋白与双链DNA的结合活性比较  41-42
    3.5.2 三种蛋白与单链DNA的结合活性比较  42-43
    3.5.3 三种蛋白与RNA的结合活性比较  43-44
4 讨论  44-48
  4.1 结核分枝杆菌Topo Ⅰ蛋白具有较强的松弛活性  44-45
  4.2 结核分枝杆菌Topo Ⅰ与DNA的相互作用的特点  45-46
  4.3 结核分枝杆菌Topo Ⅰ具有很强的RNA结合活性  46-47
  4.4 结核分枝杆菌Topo Ⅰ与大肠杆菌Topo Ⅰ、Topo Ⅲ具有不同的核酸结合性质  47-48
参考文献  48-52
致谢  52

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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