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神经生长因子活化PC-12细胞钠离子电流及IRF-1的调控作用

作　者: 朱叶牡
导　师: 潘频华
学　校: 中南大学
专　业: 内科学
关键词: 哮喘 干扰素调节因子-1 神经生长因子 PC-12细胞
分类号: R725.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的：呼吸道合胞病毒(RSV)感染的肺内神经生长因子(NGF)的表达显著增强,增加的NGF水平是否参与呼吸道合胞病毒感染后气道神经可塑性改变过程,目前还未完全明了。本实验通过神经生长因子调节类感觉神经元细胞株大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC-12细胞)中Na+离子电流变化水平,以及干扰素调节因子-1(IRF-1)的调控作用来阐明RSV感染后气道神经可塑性的机制。方法：1、用不同浓度的NGF(Ong/ml、50ng/ml及200ng/ml)刺激PC-12细胞,用全细胞膜片钳技术检测不同浓度的NGF的刺激后的Na+电流密度(INa+)。2、用不同浓度的神经生长因子(NGFOng/ml～200ng/mk)刺激PC-12细胞不同的时间,采用实施聚合酶链反应技术(Real-time PCR)检测PC-12细胞中IRF-1mRNA表达变化。3、将NGF及IFN-γ刺激的PC-12细胞分为四组,为NGF组、NGF+IFN-γ组、IFN-γ组及空白组,刺激2小时后,用蛋白质印迹技术(Western-bloting)来检测不同组中PC-12细胞核蛋白中IRF-1的活化程度。4、将干扰PC-12细胞分为三组,分别为空白组、阴性对照组及实验组,用200ng/ml NGF分别刺激干扰后的PC12细胞2小时,然后再用全细胞膜片钳技术检测感染后的不同组中Na+电流密度和电流密度-电压曲线。结果：1、不同浓度的NGF刺激PC-12细胞后所检测的Na+电流密度与不同浓度的NGF有浓度-电流密度依赖关系。2、用不同浓度的NGF刺激PC12细胞,当NGF刺激的时间为2h的时候,PC-12细胞中IRF-1mRNA表达最高。3、用Western-bloting检测不同组PC-12细胞中的IRF-1的表达时,NGF、NGF+IFN-γ、IFN-γ分别与空白组相比较,均有体统计学意义。4、在IRF-1被干扰后,用全细胞膜片钳技术检测各组中PC-12细胞中Na+电流密度,空白组为(31.26±1.72 n=5)pA/pF,阴性对照组为(34.81±0.64 n=5)pA/pF,实验组为(12.92±0.55 n=5)pA/Pf。在阴性对照组与空白组中的比较中,Na+电流密度无统计学意义。而与空白组及阴性对照组比较,实验组中的Na+电流密度明显受到抑制,有统计学意义。而I Na+I-V曲线,与实验组相比较,空白组及阴性对照组I-V曲线下移,但Na+电压依赖不变,对激活电位、峰值电位、及I-V曲线的形态轨迹无影响。结论：1.NGF可以活化PC12细胞中Na+离子电流。2.IRF-1是调控Na+离子电流的信号机制之一。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-11
英汉缩略词对照表  11-12
第一章 前言  12-14
第二章 材料与方法  14-24
  2.1 实验细胞与主要试剂及实验器材  14-15
  2.2 PC-12细胞培养  15-17
    2.2.1 PC-12细胞的准备  15-16
    2.2.2 NGF浓度梯度膜片钳试验的细胞准备  16
    2.2.3 Real-time PCR的细胞准备  16-17
    2.2.4 Western-bloting的细胞准备  17
    2.2.5 IRF-1-RNAi-LV感染用的细胞准备  17
  2.3 电溶液的配制  17-18
  2.4 Real-time PCR的试验过程  18-19
    2.4.1 RNA的提取  18
    2.4.2 去除gDNA及逆转录实验  18
    2.4.3 Real-time PCR  18-19
  2.5 NGF浓度梯度Na~+电流密度测定  19
  2.6 PC-12细胞核蛋白的提取及用Western-bloting检测IRF-1的活化  19-23
    2.6.1 常用溶液及缓冲液的配备  19-20
    2.6.2 PC-12细胞核蛋白的提取  20
    2.6.3 蛋白浓度测定  20-21
    2.6.4 SDS-PAGE电泳  21
    2.6.5 免疫印迹操作-转膜  21-22
    2.6.6 免疫检测  22
    2.6.7 显影和定影  22-23
  2.7 慢病毒干扰及Na~+电流密度和电流-电压的测定  23
    2.7.1 IRF-1-RNAi-LV配备病毒溶液  23
    2.7.2 慢病毒感染PC-12细胞(35mm2培养皿)  23
    2.7.3 NGF刺激病毒感染的PC-12细胞  23
    2.7.4 Na~+电流密度和电流-电压的测定  23
  2.8 统计学方法  23-24
第三章 结果  24-30
  3.1 NGF活化PC-12细胞后,PC-12细胞Na~+电流的变化  24-25
  3.2 NGF刺激PC-12细胞中IRF-1的表达与活化  25-27
    3.2.1 NGF在不同时间刺激下IRF-1mRNA的表达变化  25-26
    3.2.2 NGF及IFN-γ对PC-12细胞中IRF-1蛋白活化的影响  26-27
  3.3 IRF-1对NGF活化PC12细胞Na~+电流的调控作用  27-30
    3.3.1 转染实验  27-28
    3.3.2 阻断IRF-1,抑制NGF对PC-12细胞Na~+离子电流活化  28-30
第四章 讨论  30-33
第五章 结论  33-34
参考文献  34-37
综述  37-47
致谢  47

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中图分类: > 医药、卫生 > 儿科学 > 小儿内科学 > 小儿呼吸系及胸部疾病
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