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β-半乳糖苷酶催化5-氟-2\'-脱氧尿苷及其类似物区域选择性半乳糖基化反应的研究

作　者: 曾泉明
导　师: 宗敏华
学　校: 华南理工大学
专　业: 生物化工
关键词: β-半乳糖苷酶 糖基化反应 5-氟-2′-脱氧尿苷 深度共熔溶剂 离子液体
分类号: R914
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 54次
引　用: 2次
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内容摘要


5-氟-2′-脱氧尿苷(FUdR)是一种氟代脱氧核苷类似物,被广泛用于治疗各种肿瘤。但FUdR在临床上表现出较低的口服生物利用度和各种毒副作用。现已证明核苷类药物的糖基化衍生物较之亲代化合物具有更低的毒副作用。此外,二糖核苷是一类重要的天然抗生素。化学法糖基化存在区域选择性差、需要保护/脱保护步骤和环境不友好等诸多问题。无疑,反应条件温和、高效、高选择性和绿色的酶法糖基化是一条极具前景的替代途径。基于上述情况,本论文首先以来源于牛肝的β-半乳糖苷酶催化FUdR糖基化为模型反应,探讨了在缓冲液中各因素对该酶促反应的影响规律;随后,研究了该酶在核苷糖基化反应中的底物识别规律;最后,研究了混合溶剂体系中,有机溶剂、离子液体及深度共熔溶剂对酶促FUdR糖基化反应的影响规律。研究表明,在磷酸缓冲液中,来源于牛肝的β-半乳糖苷酶能高效、高5′-区域选择性地催化FUdR糖基化。在该体系中,该酶促反应的最适糖基供体、缓冲液pH、反应温度、酶量和底物摩尔比(FUdR/oNPG)分别为邻硝基苯-β-D-半乳糖苷、6.5、45℃、0.15 U mL-1和2。在上述反应条件下,反应初速度、最大产物产率和5′-区域选择性分别为0.28 mM h-1、75%和>99%。在此基础上,合成了5种结构新颖的二糖核苷(2′-脱氧尿苷、FUdR、β-胸苷、5-溴-2′-脱氧尿苷和碘苷的糖基化衍生物),收率介于45-85%之间,5′-区域选择性达92->99%。牛肝β-半乳糖苷酶在核苷糖基化反应中的底物识别研究表明,除碘苷外,目标产物最大收率随核苷上5-位基团的增大(H、F、CH3和Br)而降低。并且酶促反应的5′-区域选择性也随着5-位基团的增大而降低,其原因可能是不利的空间位阻导致5′-糖基化过渡态失稳。在混合溶剂体系中酶促反应研究表明,非水介质如有机溶剂、离子液体及深度共熔溶剂的存在易使牛肝β-半乳糖苷酶失活变性。在7种含有机溶剂体系中,该酶在含DMSO的体系中失活最小。当体系中DMSO含量低于10%(v/v)时,酶促糖基化反应收率达66%以上。在含离子液体[MMIm]MeSO4介质中,当其含量低至1%(v/v)时,糖基化产率达75%,与缓冲液体系中的产率相当。在所研究的9种含25%(v/v)DES介质中,牛肝β-半乳糖苷酶在含氯化胆碱/丙三醇体系中具有最高的活性,反应初速度和目标产物产率分别达到0.15 mM h-1和22%。体系中非水介质含量的下降能显著降低其对酶的毒害作用,而酶促FUdR糖基化反应的化学选择性随之增强。本研究不仅丰富了酶学基础理论知识,而且开辟了一条可用于核苷类化合物高效、高区域选择性糖基化的新途径,并成功地合成了几种结构新颖的核苷糖基化衍生物。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-14
第一章 绪论  14-26
  1.1 糖苷酶催化糖基化反应  14-19
    1.1.1 糖基转移酶与糖苷酶  14-17
    1.1.2 糖苷酶催化寡糖合成  17-18
    1.1.3 酶法与化学法糖基化的比较  18-19
  1.2 β-半乳糖苷酶来源、结构性质与糖苷键合成中的应用  19-21
    1.2.1 β-半乳糖苷酶的来源  19
    1.2.2 β-半乳糖苷酶结构与性质  19-20
    1.2.3 β-半乳糖苷酶在糖苷键合成中的应用  20-21
  1.3 核苷糖基化衍生物的生物活性及其合成现状  21-24
    1.3.1 核苷糖基化衍生物的生物活性  21-22
    1.3.2 核苷糖基化衍生物的合成现状  22-24
  1.4 本研究的主要内容和意义  24-26
第二章 缓冲液体系中牛肝β-半乳糖苷酶催化FUdR 及其类似物区域选择性糖基化的研究  26-52
  2.1 实验材料  27-28
    2.1.1 酶  27
    2.1.2 主要试剂  27-28
  2.2 主要仪器设备  28
  2.3 实验方法  28-35
    2.3.1 β-葡萄糖苷酶的提取  28
    2.3.2 β-糖苷酶活力的测定  28-29
    2.3.3 不同来源的β-糖苷酶催化FUdR 区域选择性糖基化反应的研究  29
    2.3.4 糖基供体对牛肝β-半乳糖苷酶催化FUdR 区域选择性糖基化反应的影响  29
    2.3.5 缓冲液pH 对牛肝β-半乳糖苷酶催化FUdR 区域选择性糖基化反应的影响  29
    2.3.6 反应温度对牛肝β-半乳糖苷酶催化FUdR 区域选择性糖基化反应的影响  29-30
    2.3.7 底物摩尔比对牛肝β-半乳糖苷酶催化FUdR 区域选择性糖基化反应的影响  30
    2.3.8 酶量对牛肝β-半乳糖苷酶催化FUdR 区域选择性糖基化反应的影响  30
    2.3.9 核苷底物结构对牛肝β-半乳糖苷酶催化核苷区域选择性糖基化反应的影响  30
    2.3.10 反应初速度、产物产率、区域选择性的计算  30-32
    2.3.11 高效液相色谱( HPLC )分析  32
    2.3.12 产物的分离纯化和结构鉴定  32-35
    2.3.13 HPLC-MS 分析  35
  2.4 结果与讨论  35-51
    2.4.1 核苷糖基化衍生物的结构鉴定  35-41
    2.4.2 不同来源的β-糖苷酶催化FUdR 区域选择性糖基化反应的研究  41-43
    2.4.3 糖基供体对牛肝β-半乳糖苷酶催化FUdR 区域选择性糖基化反应的影响  43-44
    2.4.5 缓冲液pH 对牛肝β-半乳糖苷酶催化FUdR 区域选择性糖基化反应的影响  44-45
    2.4.6 反应温度对牛肝β-半乳糖苷酶催化FUdR 区域选择性糖基化反应的影响  45-46
    2.4.7 底物摩尔比对牛肝β-半乳糖苷酶催化FUdR 区域选择性糖基化反应的影响  46-47
    2.4.8 酶量对牛肝β-半乳糖苷酶催化FUdR 区域选择性糖基化反应的影响  47-48
    2.4.9 核苷底物结构对牛肝β-半乳糖苷酶催化核苷区域选择性糖基化反应的影响  48-51
  2.5 本章小结  51-52
第三章 含有机溶剂或离子液体介质中牛肝β-半乳糖苷酶催化FUdR 区域选择性糖基化反应的研究  52-65
  3.1 实验材料  53
    3.1.1 酶  53
    3.1.2 主要试剂  53
  3.2 主要仪器设备  53-54
  3.3 实验方法  54-55
    3.3.1 β-糖苷酶活力的测定  54
    3.3.2 有机溶剂对酶促FUdR 区域选择性糖基化反应的影响  54
    3.3.3 二甲基亚砜(DMSO)含量对酶促FUdR 区域选择性糖基化反应的影响  54
    3.3.4 离子液体对酶促FUdR 区域选择性糖基化反应的影响  54-55
    3.3.5 离子液体[MMIm]MeSO_4 含量对酶促FUdR 糖基化反应的影响  55
    3.3.6 反应初速度、产物产率、区域选择性的计算  55
    3.3.7 高效液相色谱( HPLC )分析  55
    3.3.8 产物的分离纯化和结构鉴定  55
  3.4 结果与讨论  55-63
    3.4.1 有机溶剂对酶促FUdR 区域选择性糖基化反应的影响  55-59
    3.4.2 二甲基亚砜(DMSO)含量对酶促FUdR 区域选择性糖基化反应的影响  59-60
    3.4.3 离子液体对酶促FUdR 区域选择性糖基化反应的影响  60-62
    3.4.4 离子液[MMIm]MeSO_4 含量对酶促FUdR 区域选择性糖基化反应的影响  62-63
  3.5 本章小结  63-65
第四章 含深度共熔溶剂介质中牛肝β-半乳糖苷酶催化FUdR 区域选择性糖基化反应的研究  65-72
  4.1 实验材料  66
    4.1.1 酶  66
    4.1.2 主要试剂  66
  4.2 主要仪器设备  66
  4.3 实验方法  66-68
    4.3.1 β-糖苷酶活力的测定  66
    4.3.2 深度共熔溶剂的制备  66-67
    4.3.3 深度共熔溶剂对酶促FUdR 区域选择性糖基化反应的影响  67
    4.3.4 深度共熔溶剂含量对酶促FUdR 区域选择性糖基化反应的影响  67
    4.3.5 深度共熔溶剂ChCl/EG 含量对酶促FUdR 区域选择性糖基化反应的影响  67
    4.3.6 反应初速度、产物产率、区域选择性的计算  67
    4.3.7 高效液相色谱( HPLC )分析  67
    4.3.8 产物的分离纯化和结构鉴定  67-68
  4.4 结果与讨论  68-71
    4.4.1 深度共熔溶剂对酶促FUdR 区域选择性糖基化反应的影响  68-69
    4.4.2 深度共熔溶剂含量对酶促FUdR 区域选择性糖基化反应的影响  69-70
    4.4.3 深度共熔溶剂ChCl/EG 含量对酶促FUdR 区域选择性糖基化反应的影响  70-71
  4.5 本章小结  71-72
结论与展望  72-75
参考文献  75-82
附录一 校正曲线  82-86
附录二 色谱图  86-89
附录三 NMR 谱图  89-92
附录四 缩写  92-93
攻读硕士学位期间取得的研究成果  93-94
致谢  94

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药物基础科学 > 药物化学
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