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C-反应蛋白诱导晚期糖基化终产物受体表达的信号途径及其干预研究

作　者: 罗翊芝
导　师: 刘世明
学　校: 广州医学院
专　业: 内科学
关键词: C-反应蛋白动脉粥样硬化单核细胞趋化因子-1 过氧化酶物体增殖物激活型受体α 核转录因子κB 糖尿病血管内皮细胞 WY14643 晚期糖基化终产物受体
分类号: R587.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

【背景】:糖尿病是一种高花费、高致残、高死亡的疾病。其并发症已成为主要和日益严重的健康问题。心血管疾病是糖尿病患者致残、致死,并造成经济损失的主要原因。因心血管疾病而死亡的糖尿病患者中,冠心病约占一半。糖尿病动脉内皮细胞功能障碍、动脉内皮损伤,继之对血管损伤的反应提早发生和加速性动脉粥样硬化(accelerated atherosclerosis)是增加冠心病事件及导致死亡的重要原因。晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products, RAGE)在内皮功能紊乱中发挥重要作用,诱导多种黏附分子、炎症因子如细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)、E-选择素、单核细胞趋化蛋白-1 (monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)、内皮素-1(Endothelin-1, ET-1)表达升高。RAGE与配体结合后促使炎症细胞聚集、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMC)增殖、活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)生成增多,在加速性动脉粥样硬化发生、发展中起重要作用。在糖尿病相关模型的动脉粥样斑块中,晚期糖基化终产物(advanced glycation end products , AGEs)的沉积增高及RAGE表达升高。给予可溶性晚期糖基化终产物受体(soluble receptor for advanced glycation end products, sRAGE)后,斑块面积和复杂性下降,斑块变稳定。我们的前期研究发现炎症反应标记物C反应蛋白(C-reactive protein, CRP)诱导内皮细胞在mRNA及蛋白水平表达RAGE并促进MCP-1的过度生成,在加速性动脉粥样硬化的发生发展中起关键作用。在生理状态下,核转录因子κB (nuclear factor kappa B, NF-κB)与其抑制蛋白IκB结合以无活性的三聚体形式存在于胞浆中。当细胞受到刺激IκB被降解然后解除对NF-κB的抑制作用,NF-κB迅速活化进入胞核孔体内发挥基因转录的调控作用。人RAGE基因启动子含2个NF-κB元件,RAGE下游信号包括NF-κB,提示RAGE本身存在一个自我调控的正反馈回路,当RAGE与其配体结合后激活NF-κB促发后效应同时,RAGE表达可以自我上调。CRP可以通过降解IκB-α使NF-κB活化,故本实验推测CRP通过激活NF-κB诱导RAGE的生成,并予以证明。过氧化物酶体增殖物激活受体α( peroxisome proliferator-activated receptor-α, PPARα)是核受体超家族成员之一,通过结合配体活化转录因子进而调控基因表达。PPARα激动剂是临床常用治疗脂质紊乱药物,具有抗动脉粥样硬化作用。PPARα激动剂可以抑制动脉粥样硬化斑块的形成,通过降低E-选择素,VCAM-1的表达、抑制ET-1表达、减少ROS的表达、增加内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)的表达量从而发挥其抗动脉粥样作用。WY14643也称为匹立尼酸,属于PPARα配体。研究报道WY14643可以抑制CRP诱导的内皮细胞MCP-1的过度表达。根据PPAα激动剂WY14643的抗炎抗动脉粥样硬化作用,我们推测WY14643可能可以抑制CRP诱导内皮细胞生成RAGE和MCP-1。因此目前研究主要目的为探讨CRP-RAGE-MCP-1轴的作用机制及WY14643的干预作用。【方法】:1.人脐静脉内皮细胞的体外原代培养及传代培养;2.利用流式细胞技术检测WY14643对内皮细胞表达RAGE蛋白的影响;3.利用RT-PCR检测WY14643对内皮细胞表达RAGE mRNA的影响;4.利用ELISA法检测CRP上调内皮细胞RAGE的表达是否通过NF-κB途径及WY14643对其影响;5.利用流式细胞技术检测CRP上调内皮细胞RAGE蛋白表达是非通过NF-κB途径及WY14643对其影响;6.利用RT-PCR检测CRP上调内皮细胞RAGE mRNA表达是非通过NF-κB途径及WY14643对其影响;7.利用ELISA方法检测CRP上调内皮细胞表达MCP-1是非通过NF-κB途径及WY14643对其影响。【结果】:1. WY14643对内皮细胞表达RAGE蛋白的影响(流式细胞技术)1)不同浓度WY14643作用内皮细胞24小时对RAGE蛋白表达的影响与对照组相比,加入WY14643 10μM即可见RAGE蛋白表达量下降(P<0.05),在WY14643 100μM时RAGE蛋白表达抑制更为明显(P<0.01),WY14643浓度为250μM时RAGE蛋白表达量最低(P<0.01)。2) 250μM WY14643作用内皮细胞不同时间对RAGE蛋白表达的影响WY14643组RAGE蛋白的量均低于对照组(P<0.01)。RAGE蛋白表达量在培养6小时即有下降,并在24小时达到最小值。2. WY14643对内皮细胞表达RAGE mRNA的影响(RT-PCR法)1)不同浓度WY14643作用内皮细胞24小时对RAGE mRNA表达的影响加入WY14643 10μM即可见RAGE mRNA表达量有所下降(P<0.05),WY14643 100μM对RAGE mRNA表达抑制更加明显(P<0.05),WY14643浓度为250μM时抑制RAGE mRNA表达最明显(P<0.05)。2) 250μM WY14643作用内皮细胞不同时间对RAGE mRNA表达的影响将250μM WY14643加入内皮细胞培养不同时间(6、12、24小时),发现WY14643组中目标基因PCR产量均低于对照组(P<0.05)。RAGE mRNA表达量在培养6小时即有下降,并在24小时达到最低值。3. CRP通过激活NF-κB诱导内皮细胞表达RAGE,并可被WY14643抑制(流式细胞技术,RT-PCR法,ELISA法)1)流式细胞技术检测RAGE蛋白表达与对照组相比,CRP组RAGE蛋白表达升高(P<0.05)。提前1小时加入NF-κB拮抗剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(1-Pyrrolidinecarbodithioic Acid, PDTC)阻断NF-κB途径再加CRP作用内皮细胞发现RAGE蛋白表达较CRP组下降(P<0.05)。CRP和WY14643共作用组RAGE蛋白表达较CRP组下降(P<0.05)。2) RT-PCR检测RAGE mRNA表达与对照组相比,CRP组RAGE mRNA表达升高(P<0.01)。CRP与PDTC共作用组RAGE mRNA表达较CRP组明显下降(P<0.01)。CRP与WY14643共作用组RAGE mRNA表达较CRP组明显下降(P<0.01)。3) ELISA检测磷酸化NF-κB p65水平与对照组比较,CRP组磷酸化NF-κB p65水平升高(P<0.05)。CRP与PDTC共作用组及CRP与WY14643共作用组磷酸化NF-κB p65水平较CRP组明显下降(P<0.05)。4.CRP通过激活NF-κB诱导内皮细胞表达MCP-1,并可被WY14643抑制(ELISA法)ELISA检测MCP-1表达:与对照组比较,CRP组MCP-1水平明显升高(P<0.01)。CRP与PDTC共作用组或与WY14643共作用组MCP-1水平较CRP组明显下降(P<0.01)。【结论】:本实验结果提示CRP通过激活NF-κB途径诱导内皮细胞RAGE和MCP-1的表达。WY 14643可以从蛋白和mRNA水平抑制内皮细胞RAGE的表达,在一定程度内呈浓度-时间效应;并抑制CRP诱导内皮细胞RAGE和MCP-1的表达,从而阻断CRP-RAGE-MCP-1轴。为治疗加速动脉粥样硬化提供可能的途径。

全文目录

中文摘要  4-8
英文摘要  8-12
前言  12-16
  一、糖尿病与加速性动脉粥样硬化  12
  二、晚期糖基化终产物受体与加速性动脉粥样硬化  12-13
  三、CRP与动脉粥样硬化  13-14
  四、CRP诱导内皮细胞RAGE表达的作用机制与NF-κ B途径  14
  五、PPARα的抗动脉粥样硬化作用  14-16
材料与方法  16-27
结果  27-34
讨论  34-39
结论  39-40
参考文献  40-45
综述  45-51
  参考文献  49-51
致谢  51-52

C-反应蛋白诱导晚期糖基化终产物受体表达的信号途径及其干预研究

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