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氯霉素类抗生素全抗原合成及单克隆抗体制备的初步研究

作　者: 褚文雷
导　师: 崔杰
学　校: 哈尔滨工业大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 氯霉素类抗生素全抗原多克隆抗体细胞融合杂交瘤细胞
分类号: S859
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

氯霉素类抗生素属于酰胺醇类广谱抗生素,因其效高价廉,临床上广泛用于预防和治疗感染性疾病,并起到了重要的作用。随着氯霉素的广泛应用及研究的深入,发现其有许多毒、副作用,在动物性食品中的残留因其生态环境污染和对人类健康的潜在危害已倍受关注,因此,许多发达国家相继禁止或严格限制使用氯霉素,或使用其他氯霉素类抗生素代替。传统的氯霉素残留分析方法中虽然有些方法灵敏、准确,但是样品前处理步骤繁琐,需要昂贵的仪器和专业技术人员,且周期长、成本高,不能满足现场和快速检测的要求。因此,建立高效、灵敏、经济的氯霉素残留分析方法是很有必要的。酶联免疫吸附检测法(ELISA)以及胶体金免疫层析技术(GICA)是利用抗原和抗体的特异性结合反应对微量抗原或抗体进行测定的方法,是一种快速、简便、特异性好并且灵敏度较高的免疫测定技术。本实验的主要目的是研究合成氯霉素类抗生素全抗原,通过免疫小鼠建立分泌氯霉素类抗生素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为今后建立快速、简便、特异性好、灵敏度高的免疫检测技术打下基础。用酯化法合成了氯霉素类抗生素半抗原的中间体,选用重氮化法或混合酸酐法合成了氯霉素类(包括氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素)抗生素免疫抗原和包被抗原,纯化后,利用紫外吸收光谱扫描及红外光谱扫描方法检测人工合成抗原,结果偶联成功,方法有效。利用合成的4种人工抗原制备免疫抗原,分别免疫6~8周龄BALB/c小鼠各5只,待免疫8~10次后采尾血,得到各种抗血清。利用间接非竞争酶联免疫吸附测定法检测样品抗血清效价,结果均达到1:6400,此样品可用于进一步实验研究。取高效价的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,用HAT培养基筛选培养,在融合后第4或5d出现小的克隆,第10d杂交瘤细胞铺满孔底的60%,用建立的间接ELISA法筛选阳性孔,筛选得到阳性杂交瘤细胞。本实验成功摸索出3种氯霉素类抗生素人工抗原合成的适宜方法,并合成出4种全抗原。利用细胞融合技术,成功制备了分泌氯霉素类抗生素单克隆抗体杂交瘤细胞株,为建立氯霉素类药物免疫学检测方法奠定了坚实基础。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
第1章绪论  10-20
  1.1 课题背景  10-11
  1.2 氯霉素类抗生素的理化性质  11
  1.3 氯霉素类抗生素的作用机理  11-12
  1.4 氯霉素类抗生素残留的危害  12-13
    1.4.1 对人体的危害  12
    1.4.2 对畜禽的危害  12
    1.4.3 对我国声誉的损害  12-13
  1.5 氯霉素类抗生素残留检测的研究现状及分析  13-15
    1.5.1 微生物学方法  13
    1.5.2 免疫分析方法  13-14
    1.5.3 色谱技术  14-15
    1.5.4 其他分析方法  15
  1.6 人工抗原合成的方法  15-16
  1.7 单克隆抗体的制备  16-18
    1.7.1 单克隆抗体的概念和特性  16
    1.7.2 单克隆抗体的应用  16-18
    1.7.3 单克隆抗体技术的展望  18
  1.8 研究目的及意义  18
  1.9 本课题主要研究内容  18-20
第2章实验材料与方法  20-29
  2.1 实验试剂及材料  20
  2.2 实验仪器及设备  20-21
  2.3 实验动物  21
    2.3.1 实验动物的来源  21
    2.3.2 实验动物的要求  21
    2.3.3 实验动物的饲养  21
    2.3.4 实验动物的管理  21
  2.4 实验所需溶液的配制  21-23
    2.4.1 全抗原合成实验所需溶液  21
    2.4.2 间接间接ELISA实验所需溶液  21-22
    2.4.3 细胞融合与培养实验所需溶液  22-23
  2.5 实验方法  23-29
    2.5.1 氯霉素全抗原合成方法  23-24
    2.5.2 甲砜霉素全抗原合成方法  24
    2.5.3 氟甲砜霉素全抗原合成方法  24-25
    2.5.4 三种抗生素包被抗原合成方法  25
    2.5.5 三种抗生素全抗原的鉴定  25-26
    2.5.6 免疫用抗原的制备  26
    2.5.7 小鼠免疫  26
    2.5.8 间接ELISA检测方法的建立及血清效价检测  26-27
    2.5.9 SP2/0 骨髓瘤细胞的复苏  27
    2.5.10 饲养细胞的制备  27-28
    2.5.11 脾细胞的制备  28
    2.5.12 细胞融合  28
    2.5.13 阳性融合细胞的筛选和培养  28-29
第3章氯霉素类抗生素全抗原的合成与鉴定  29-39
  3.1 氯霉素类抗生素全抗原的合成  29
  3.2 氯霉素类抗生素全抗原的紫外图谱分析  29-32
  3.3 氯霉素类抗生素全抗原的红外图谱分析  32-37
  3.4 分析讨论  37-38
  3.5 本章小结  38-39
第4章氯霉素类抗生素多克隆抗体制备及血清鉴定  39-44
  4.1 多克隆抗体的制备  39
  4.2 抗血清效价检测  39-41
  4.3 分析讨论  41-43
    4.3.1 免疫动物的选择  41
    4.3.2 免疫过程中的问题  41
    4.3.3 抗血清效价的测定  41-43
  4.4 本章小结  43-44
第5章细胞融合培养及杂交瘤细胞株的初步筛选  44-49
  5.1 骨髓瘤细胞的复苏  44
  5.2 饲养细胞的制备  44-45
  5.3 细胞融合培养  45-46
  5.4 阳性融合细胞的筛选  46
  5.5 分析讨论  46-48
    5.5.1 骨髓瘤细胞的选择  46-47
    5.5.2 饲养细胞对细胞融合的影响  47
    5.5.3 融合剂的选择  47-48
    5.5.4 细胞融合  48
    5.5.5 细胞培养中容易出现的问题和解决办法  48
  5.6 本章小结  48-49
结论  49-50
参考文献  50-55
攻读学位期间发表的学术论文  55-57
致谢  57

氯霉素类抗生素全抗原合成及单克隆抗体制备的初步研究

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