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产头孢菌素酰化酶重组大肠杆菌发酵工艺的研究

作　者: 赵娟
导　师: 李晋平
学　校: 太原理工大学
专　业: 化学工程
关键词: 头孢菌素C 7-氨基头孢烷酸头孢菌素C酰化酶重组大肠杆菌
分类号: TQ464.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

7-氨基头孢烷酸(7-ACA)作为生产许多半合成头孢菌素类抗生素的中间体,在医药工业具有重要价值。目前,工业化生产7-ACA方法中化学法有诸多弊端,而二步酶法生产7-ACA的工艺中又普遍存在酶活较低且生产成本高的问题。因此筛选能够产高活力头孢菌素C酰化酶(CPC酰化酶)的菌株和改造已有的低活力CPC酰化酶菌株是解决这个问题的关键所在。本文研究了基因工程菌发酵产CPC酰化酶及酶[0]其催化制备7-ACA的工艺。通过对提取重组大肠杆菌中粗酶的不同破碎方法的选择,进一步改变超声过程中的各参数,确定了最佳超声破碎条件;对粗酶液进行了纯化,但所选的硫酸铵盐析法和等电点沉淀法对蛋白质纯化后的结果都不理想。实验结果表明:超声破碎法较好,得到的粗酶液酶活力最高;最佳超声破碎条件为,输出功率200W,破碎次数30次,占空比为1/2;硫酸铵盐析法纯化处理后,酶活下降了44%;等电点沉淀处理后酶的变性问题严重,酶液几乎没有酶活。考虑到一般工业用酶的纯度要求不高,过度的纯化反而会提高成本,并且降低酶活和回收率,因此,在今后的实验中直接使用粗酶液进行酶活测定。筛选了LB、TB、玉米浆、M9和LBG5种培养基,不同碳源和氮源以及金属离子对酶活的影响,进一步研究了不同葡萄糖浓度对于酶活和重组大肠杆菌生物量的影响。实验结果表明:确定LBG培养基为几种培养基中最佳培养基,以葡萄糖作为碳源的生物量和酶活最高,可达到13.38U/L,是LB基础培养基的2.64倍;葡萄糖浓度5g/L时为最佳添加浓度,其酶活可达到14.69U/L,为LB基础培养基的3倍;有机氮源中酵母粉为影响显著的氮源,且以(NH4)2SO4作为无机氮源时,对酶活的提高有促进作用; Mn+对该重组大肠杆菌的生长和酶活促进作用最大,酶活达到酶活达到了18.12U/L,比对照提高了53%。。通过单因素实验,确定了发酵过程中各参数的最优条件:发酵温度25℃,发酵时间36h,发酵培养基pH8.0。根据单因素实验结果设计了正交实验,确定最佳发酵工艺条件为pH8.0、温度为25℃、接种量为800μl、种龄OD为0.2和发酵时间为24h。验证实验表明,采用该条件进行发酵,酶活为25.06U/L,可以达到较高的水平。对CPC酰化酶制备7-ACA反应工艺条件进行了优化,结果表明:CPC酰化酶在37℃、pH 7~8、底物浓度4mg/mL时,酶活力最高,催化生成的7-ACA量最大,CPC酰化酶在5h以内时对温度稳定性较好。

全文目录

摘要  2-4
ABSTRACT  4-12
第一章绪论  12-34
  1.1 引言  12
  1.2 头孢菌素概述  12-16
    1.2.1 头孢菌素分类  12-13
    1.2.2 头孢菌素结构及作用机制  13-15
    1.2.3 国内外头孢菌素的产销状况  15-16
  1.3 7-氨基头孢烷酸概述  16-23
    1.3.1 7-ACA 简介  16-17
    1.3.2 7-ACA 的生产方法  17-21
      1.3.2.1 化学裂解法  17-20
      1.3.2.2 酶法裂解  20-21
    1.3.3 以7-ACA 为原料的产品  21
    1.3.4 生产7-ACA 的反应器  21-22
    1.3.5 7-ACA 的生产状况  22-23
    1.3.6 我国目前7-ACA 生产存在的问题  23
  1.4 头孢菌素酰化酶概述  23-30
    1.4.1 头孢菌素酰化酶的分类和来源  23-25
    1.4.2 头孢菌素酰化酶的生理功能及酶学特性  25-27
      1.4.2.1 结构和生理功能  25-26
      1.4.2.2 头孢菌素酰化酶的酶学特性  26-27
    1.4.3 头孢菌素酰化酶基因的克隆与表达  27-29
    1.4.4 头孢菌素酰化酶的纯化和固定化  29
    1.4.5 头孢菌素酰化酶的应用前景  29-30
  1.5 细胞破碎方法概述  30-32
    1.5.1 细胞破碎技术的分类  30
    1.5.2 常用细胞破碎技术的简介  30-32
    1.5.3 机械法与非机械法的比较  32
  1.6 本课题的选题目的、意义和主要研究内容  32-34
    1.6.1 选题目的、意义  32-33
    1.6.2 研究内容  33-34
第二章试验材料与分析方法的建立  34-44
  2.1 试验材料  34-37
    2.1.1 菌种  34
    2.1.2 主要试剂  34-36
    2.1.3 试验仪器  36
    2.1.4 培养基  36-37
    2.1.5 缓冲液的配置  37
  2.2 实验方法  37-38
    2.2.1 重组大肠杆菌培养  37
      2.2.1.1 培养基灭菌条件  37
    2.2.2 斜面培养  37
    2.2.3 种子培养  37-38
  2.3 分析方法  38-44
    2.3.1 菌体浓度的测定  38-39
    2.3.2 考马斯亮蓝法测定总蛋白的量  39-40
      2.3.2.1 原理  39
      2.3.2.2 试剂的配制  39
      2.3.2.3 标准曲线制作  39-40
    2.3.3 粗酶液中总蛋白质浓度的测定  40-42
      2.3.3.1 对二甲氨基苯甲醛（PDAB）比色法测定头孢菌素C 酰化酶活力  40-41
      2.3.3.2 HPLC 验证 CPC acylase 催化 CPC 生成 7-ACA  41-42
    2.3.4 葡萄糖及反应过程中乙酸浓度的测定  42-44
第三章产头孢菌素酰化酶重组大肠杆菌破碎条件和纯化的研究  44-51
  3.1 引言  44
  3.2 实验方法  44-46
    3.2.1 不同破碎细胞壁方法  44-45
    3.2.2 超声破碎方法  45
    3.2.3 硫酸铵盐析沉淀法  45
    3.2.4 等电点沉淀法  45-46
  3.3 结果与讨论  46-50
    3.3.1 不同破碎细胞壁方法对酶活性的影响  46-47
    3.3.2 超声功率和次数对重组大肠杆菌酶活的影响  47-48
    3.3.3 超声占空比对重组大肠杆菌酶活的影响  48-49
    3.3.4 硫酸铵盐析沉淀法对酶活的影响  49
    3.3.5 等电点沉淀法对酶活的影响  49-50
  3.4 本章小结  50-51
第四章产CPC 酰化酶重组大肠杆菌发酵的培养基优化  51-59
  4.1 引言  51
  4.2 实验方法  51-52
    4.2.1 不同培养基的配置方法  51
    4.2.2 不同种类碳源的选取  51
    4.2.3 不同葡萄糖浓度的选取  51-52
    4.2.4 不同氮源的选取  52
    4.2.5 金属离子的选取  52
  4.3 结果与讨论  52-58
    4.3.1 不同培养基对酶活的影响  52-53
    4.3.2 不同碳源对酶活的影响  53
    4.3.3 不同葡萄糖浓度对酶活的影响  53-55
    4.3.4 不同氮源对酶活的影响  55-57
    4.3.5 不同金属离子对酶活的影响  57-58
  4.4 本章小结  58-59
第五章产头CPC 酰化酶重组大肠杆菌摇瓶分批发酵条件优化  59-69
  5.1 引言  59
  5.2 试验方法  59-60
    5.2.1 细胞生长曲线的绘制  59
    5.2.2 酶活曲线的绘制  59
    5.2.3 发酵温度的选取  59
    5.2.4 接种量的选取  59-60
    5.2.5 接种菌龄的选取  60
    5.2.6 PH 的选取  60
    5.2.7 正交试验设计优化发酵条件  60
  5.3 结果和讨论  60-68
    5.3.1 重组大肠杆菌种子培养的细胞生长曲线  60-61
    5.3.2 摇瓶分批发酵工艺条件的优化  61-66
      5.3.2.1 酶活曲线  61
      5.3.2.2 温度对发酵过程及酶活的影响  61-63
      5.3.2.3 接种量对发酵过程及酶活的影响  63-64
      5.3.2.4 接种菌龄对发酵过程及酶活的影响  64-65
      5.3.2.5 PH 对发酵过程及酶活的影响  65-66
    5.3.3 正交试验设计优化发酵条件  66-68
  5.4 本章小结  68-69
第六章 CPC 酰化酶催化CPC 生成7-ACA 反应条件研究  69-74
  6.1 引言  69
  6.2 试验方法  69
    6.2.1 CPC 酰化酶酶促反应速率测定方法  69
    6.2.2 CPC 酰化酶在不同浓度底物下的催化反应  69
    6.2.3 CPC 酰化酶在不同PH 底物下的催化反应  69
    6.2.4 CPC 酰化酶在不同反应温度下的催化反应  69
    6.2.5 CPC 酰化酶在最佳温度下的稳定性  69
  6.3 实验结果与讨论  69-73
    6.3.1 CPC 酰化酶酶促反应速率  69-70
    6.3.2 底物浓度对酶活的影响  70-71
    6.3.3 底物PH 对酶活的影响  71
    6.3.4 反应温度对酶活的影响  71-72
    6.3.5 最佳温度下酶活的稳定性  72-73
  6.4 本章小结  73-74
第七章结论  74-76
参考文献  76-82
致谢  82-83
攻读硕士学位期间发表学术论文  83

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