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谷氨酰胺合成酶的表达、纯化、酶学性质及腺苷化现象的研究

作　者: 李业
导　师: 曹竹安
学　校: 清华大学
专　业: 化学工程与技术
关键词: 谷氨酸棒杆菌谷氨酰胺合成酶融合表达酶学性质同源建模
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 94次
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内容摘要

L-谷氨酰胺是一种具有高附加值的化合物。酶法作为近年来新兴的方法是对生产L-谷氨酰胺新的探索,具有理论研究和实际生产双重意义。本论文对酶法生产谷氨酰胺的关键酶-谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的谷氨酰胺合成酶(简称GS)进行研究,探索了GS与组氨酸标签(His-tag)融合表达情况;探索了GS在E .coli中增加可溶表达的策略;纯化了GS,研究了其酶学性质;研究了GS的腺苷化以及腺苷化位点定点突变对GS性质的影响。首先考察了GS与组氨酸标签(His-tag)融合对其表达的影响。相比野生GS,N端His-tag对GS可溶表达及酶活影响不大;C端His-tag导致GS完全不可溶表达。生物信息学的分析推测C端His-tag引起GS完全不可溶表达可能是其影响了GS的折叠的动力学过程,而非引起其热力学构象的变化。另外,凝胶过滤色谱表明谷氨酸棒杆菌GS的四级结构存在6聚体和12聚体两种形式。利用T7系统在E. coli中表达野生或N端融合His-tag的GS部分可溶,但大部分以包涵体形式存在。本文随后探索了麦芽糖结合蛋白(MBP)融合、减弱启动子强度和更换宿主细胞对增加GS表达可溶性的影响。结果表明MBP与GS融合表达显著增加了可溶性,但GS酶活完全丧失;Tac启动子使GS可溶组分和包涵体均大幅降低;宿主细胞的改变对GS可溶表达影响不大。利用固定化金属螯合亲和色谱纯化出了N端融合重组His-tag的可溶GS,纯度达90%以上。随后研究了pH、温度、金属离子对GS的影响。发现了GS与底物ATP有相互作用引起OD340吸收,这导致了酶动力学常数无法测量。最后研究了GS腺苷化现象。结果发现,E. coli诱导表达GS过程中外源添加不同浓度的谷氨酰胺对腺苷化程度变化影响不大,均有25%被腺苷化。通过Tyr405Phe定点突变去除了GS腺苷化位点,但野生和突变GS性质对比发现突变引起活性下降已超过了25%腺苷化的影响。同源模型分析表明,Tyr405不仅是腺苷化位点,也位于GS催化中心。定点突变导致活性中心出口的一个柔性环不能有效闭合,引起GS催化活性降低。

谷氨酰胺合成酶的表达、纯化、酶学性质及腺苷化现象的研究

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