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文蛤外套膜和肝胰脏组织cDNA文库的构建及其线粒体全基因组序列的扩增

作　者: 宋文涛
导　师: 赫崇波
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 文蛤 cDNA文库 表达序列标签 线粒体基因组
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


文蛤(Meretrix meretrix)属软体动物门(Mollusca)、双壳纲(Lamellibranchia)、异齿亚纲(Heterodonta)、帘蛤目(Veneroida)、帘蛤科(Veneridae)、文蛤属(Meretrix)。文蛤是一种天然资源丰富的滩涂贝类,具有较高的营养和药用价值,是重要的海水增养殖优良品种,也是主要出口的鲜活水产品之一。本研究构建了文蛤外套膜和脾脏组织的cDNA文库、EST测序、序列分析,设计引物扩增线粒体基因组序列,并利用生物信息学方法,对16种双壳贝类的线粒体基因组的结构特征进行了研究。1.运用TRIZOL Reagent提取文蛤外套膜和脾脏组织的总RNA,用SMART cDNALibrary Construction Kit构建cDNA文库。经测定原始文库滴度分别为1.70×10~6和1.60×10~6,重组率分别为96.5%和95.2%,插入片段平均长度分别为705 bp和750 bp,文库质量符合标准要求。2.随机选取文库的2112个克隆进行5′端测序,获得高质量EST序列2023个(外套膜:1019,肝胰脏:1004),测序成功率95.8%。经质量控制和拼接得到1322个单基因簇(Unigene),其中231个叠联群(Contigs),1147个单一序列(Singletons)。通过Blastx和Blastn搜索比对、查询和注释分析,共得到已知基因480个(外套膜:235个;肝胰脏:245个),占总数36.3%。3.利用Gene Ontology法对所有ESTs进行基因功能分析,建立了文蛤不同组织的基因表达谱,表明参与结合和催化分子功能的基因的表达非常活跃。4.在1322个Unigene发现微卫星序列32条,设计引物22对,这些存在微卫星位点的序列占整个ESTs数据库的2.3%。5.根据文蛤cDNA文库中筛选出的线粒体基因片段设计正反向引物(CO3-F与ND5-R,ND5-F与CO3-R),扩增了10 kb和7 kb左右的大片段产物,2个片段可覆盖线粒体全基因组。6.对已登录到GenBank中的16种双壳贝类的线粒体基因组的结构特征分析发现,双壳贝类线粒体的基因组结构、基因排列顺序没有明显的规律。用基因组全序列聚类时,16种贝类的聚类结果与传统的形态学分类情况基本相同;而蛋白质编码序列聚类时,所得的系统分类情况与这些贝类传统的形态学分类相差较大。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-7
第一章 文献综述  7-14
  1 文蛤概述  7-9
    1.1. 分类地位、种类及分布  7
    1.2. 形态特征  7-8
    1.3. 生态习性  8
    1.4. 我国文蛤养殖业现状  8
    1.5. 文蛤的分子生物学研究  8-9
  2 cDNA文库概述  9-13
    2.1. cDNA文库的概念  9
    2.2. cDNA文库类型  9-10
    2.3. cDNA文库构建及EST分析流程  10-11
    2.4. cDNA文库的应用  11-12
    2.5. EST技术的局限性  12-13
    2.6. SMART技术  13
  3 本研究目的和意义  13-14
第二章 文蛤cDNA文库的构建及部分ESTs初步分析  14-38
  1 材料和方法  14-21
    1.1. 材料  14
    1.2. 方法  14-21
  2 结果  21-36
    2.1. 总RNA的提取和mRNA的纯化  21-22
    2.2. 双链cDNA的合成  22
    2.3. cDNA文库的鉴定  22-23
    2.4. EST测序结果的初步统计分析  23-27
    2.5. 已知EST基因分类  27-30
    2.6. 基因表达谱的构建  30-33
    2.7. 微卫星位点的筛选  33-36
  3 讨论  36-38
    3.1. SMART技术  36
    3.2. 总RNA的提取  36
    3.3. 文库构建  36-37
    3.4. EST测序  37
    3.5. 结果分析  37-38
第三章 文蛤线粒体全基因组序列扩增  38-45
  1 前言  38-39
    1.1. 线粒体DNA的结构与特性  38
    1.2. 线粒体DNA多态性  38-39
    1.3. 双壳贝类线粒体基因的应用  39
  2 文蛤线粒体基因组的扩增  39-42
    2.1. 材料和方法  39-40
    2.2. 实验方法  40-42
  3 结果  42-43
    3.1. 基因组总DNA提取结果  42
    3.2. PCR扩增结果  42-43
  4 讨论  43-45
    4.1. 引物设计  43
    4.2. PCR试验条件的优化  43-45
第四章 双壳贝类线粒体基因组结构的比较研究  45-52
  1 双壳贝类线粒体基因组  45-46
  2 基因组结构和基因排列  46-48
  3 碱基组成  48
  4 编码基因密码子  48-49
  5 控制区序列  49
  6 系统进化分析  49-50
  7 讨论  50-52
结论  52-53
参考文献  53-58
致谢  58-59
论文发表情况  59-60

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产基础科学 > 水产生物学 > 水产动物学
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