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致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌cya、crp双基因缺失突变株的构建及其相关功能性分析

作　者: 王锴
导　师: 朱国强
学　校: 扬州大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 禽致病性大肠杆菌 λRed重组系统 cya、crp突变生物学特性
分类号: S852.61
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

鹅卵黄性腹膜炎(俗称蛋子瘟),多发于产蛋高峰期的种鹅群,该病死亡率较高并且可导致种蛋受精率和出雏率下降,它是家禽重要的细菌性传染病,病原为禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli, APEC),且易与其它病原性细菌、病毒并发或混合感染,本病已严重影响到养鹅业的发展。由于APEC血清型众多,目前尚无商品化疫苗使用,并且伴随细菌耐药性问题的日趋严重,该病的药物控制越来越受到严格限制。如何致弱APEC病原菌,获取免疫原性能好、低或无毒性的活菌疫苗以有效抵抗APEC病原菌的感染已成为养鹅业迫在眉睫的问题。随着研究的深入,发现某些管家基因的缺失会引起细菌毒力的减弱,例如cya(adenylate cyclase)、crp(cAMP receptor protein)基因。这两个基因分别是编码合成cAMP的腺苷酸环化酶以及编码cAMP的受体蛋白CRP。cAMP与CRP是菌体转运和降解营养物质过程中的调控因子,cAMP受体蛋白CRP也是目前已知的大肠杆菌7个总调控蛋白中最为重要的一个,它调控了约50%的转录单位的起始。鉴于cya、crp基因的重要作用,其与致病因子的关系必然成为近来研究的一个热点。已有报道国外学者已在鼠伤寒沙门氏菌和APEC病原菌O2,O78血清型中成功构建cya、crp双基因缺失株,并在动物体内证实缺失株毒力的致弱,且保留了良好的免疫原性。本实验基于cya、crp基因的已知序列,利用λ噬菌体Red重组系统对致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌优势血清型国内分离株G8107(血清型O2:K89)、G803(血清型O39:K89)、G8102(血清型未定),和大肠杆菌J5(脂多糖突变株)的cya、crp基因进行敲除,构建△cya△crp双突变株。其主要构建步骤为:首先PCR扩增出两翼与cya基因上下游序列同源,中间为氯霉素抗性基因的DNA片段,然后转化入G8107、G803、G8102和J5,在Red重组系统表达重组酶的帮助下,含氯霉素抗性基因的PCR产物通过其两侧的cya基因同源序列与禽大肠杆菌染色体上的cya基因发生同源重组,通过氯霉素抗性平板筛选得到阳性克隆,对筛选得到的阳性克隆再导入编码Flp重组酶的质粒pCP20,通过第二次重组去除抗性基因,结合PCR扩增和测序鉴定,从而证明△cya突变株G8107△cya、G803△cya、G8102△cya、J5△cya构建正确。在成功构建△cya突变株的基础上用相同的方法继续构建△cya△crp双基因突变株。在成功构建单突变株△cya与双突变株△cya△crp缺失株的基础上,比较分析了野生株和单突变株以及双突变株在糖酵解、生长速度、毒力致弱方面的生物学特性。突变株体外酵解试验表明,与野生株不同,其不能正常利用乳糖、麦芽糖、蔗糖;生长速度试验表明突变株明显低于野生株,这是由于细菌缺少在转运和降解营养物质过程中发挥调节作用的cya、crp基因,从侧面证实cya、crp基因的正确缺失。通过一日龄气管环接种雏鸡构建动物模型,检测突变株毒力试验,结果表明6日内最高剂量组(3×109CFU)中野生株、△cya突变株、△cya△crp双突变株的死亡率分别为60%、20%、0%,实验结果表明了双突变株毒力较大程度的减弱。本实验利用Red重组系统,成功构建了致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌国内优势血清型分离株G8107、G8102、G803的△cya、△cya△crp突变株,并且证实了缺失株毒力的致弱。基因缺失减毒株的成功构建,为进一步深入研究禽致病性大肠杆菌管家基因cya、crp与其致病力相互作用的关系提供了一种新的方法,以及为研制禽致病性大肠杆菌活菌弱毒苗奠定基础。

全文目录

中文摘要  4-6
Abstract  6-12
符号说明  12-13
文献综述  13-32
  一、禽致病性大肠杆菌相关毒力基因  13-18
    1.1 毒力岛  13
    1.2 菌毛  13-14
    1.3 摄铁系统  14-15
    1.4 毒素  15
    1.5 细菌抗宿主杀伤因子  15-16
    1.6 管家基因  16-17
    1.7 结论  17-18
  二、Red 同源重组技术研究进展  18-25
    2.1 Red 重组系统的结构及其重组机制  18-19
    2.2 Red 同源重组类型  19-21
    2.4 常用Red 同源重组系统相关质粒介绍  21-23
    2.5 Red 同源重组基因敲除的策略及技术难点  23-24
    2.6 Red 重组技术的应用前景展望  24-25
  参考文献  25-32
研究一、致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌cya、crp 双基因缺失突变株的构建  32-47
  摘要  32-34
  1. 材料  34-35
    1.1 菌株、质粒  34
    1.2 培养基和主要试剂  34-35
    1.3 主要仪器  35
  2. 方法  35-40
    2.1 PCR 引物的设计  35-36
    2.2 融合PCR 产物的制备和纯化  36-37
    2.3 感受态细胞的制备及转化  37
    2.4 电转化  37-38
    2.5 质粒pKD46 的消除  38
    2.6 第一次同源重组菌△cya::Cat 的PCR 鉴定  38-39
    2.7 FLP 位点专一性重组  39
    2.8 第二次重组菌△cya 的鉴定  39-40
    2.9 禽致病性大肠杆菌△cya 突变株中crp 基因的缺失  40
  3. 结果  40-44
    3.1 融合PCR 产物的制备  40
    3.2 第一次同源重组菌△cya::Cat 、△cya△crp::Cat 的PCR 鉴定  40-42
    3.3 第二次重组菌△cya、△cya△crp 的鉴定  42-43
    3.4 鉴定引物P3、P4；P7、P8 扩增△cya、△cya△crp 菌株染色体上序列分析  43-44
  4. 讨论  44-46
  参考文献  46-47
研究二、致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌△cya△crp 双基因缺失突变株的相关功能性分析  47-59
  摘要  47-48
  1. 材料  48-49
    1.1 菌株  48
    1.2 实验动物  48
    1.3 培养基  48
    1.4 主要试剂及配制  48-49
    1.5 仪器设备  49
  2. 方法  49-51
    2.1 细菌的生化鉴定  49
    2.2 细菌生长曲线测定  49
    2.3 突变株对鸡的致病力研究  49-51
  3. 结果  51-55
    3.1 细菌的生化鉴定  51
    3.2 突变株的生长曲线测定  51-53
    3.3 动物实验  53-55
  4. 讨论  55-57
  参考文献  57-59
致谢  59

致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌cya、crp双基因缺失突变株的构建及其相关功能性分析

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