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两株新城疫病毒分离株全基因组序列的测定及在CEF和鸡胚传代的含量变化分析

作　者: 孙委委
导　师: 孔宪刚
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 新城疫病毒遗传进化分析同源性比较病毒传代病毒含量检测
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

新城疫(Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒(ND virus, NDV)引起的一种禽类急性、高度接触性和致死性传染病。对养禽业造成很大的经济损失。新城疫在世界范围共引起4次大流行,每次大流行都有新的基因型产生,现在世界范围都普遍采用疫苗接种的方法预防新城疫,但在免疫鸡群中还时有发生,该病毒宿主范围很广,但在新城疫最开始爆发时期,在水禽体内只是隐性感染,并不致病,但自1997年在我国南部多数省份的鹅体内分离到的强毒株并引起鹅死亡,现在从鸡体内分离到的新城疫病毒很多和水禽源的新城疫病毒的亲缘关系很高,对水禽的新城疫的预防免疫也不容忽视。本研究于2008年在山东鸡场某免疫鸡群发病鸡体内分离到的病毒,经病毒的分离鉴定证明该分离病毒为NDV,根据GenBank公布的新城疫病毒的全基因序列,在同源区设计14对引物扩增接种SPF鸡胚尿囊腔P1代的病毒的全基因组,并进行测序分析。又将该病毒接种CEF进行噬斑纯化,共挑取5个克隆株进行全基因组的测序分析,发现接种鸡胚尿囊腔(ck/CH/LSD/08-29)和接种CEF的病毒毒株(ck/CH/LSD/08-29(CEF))的全基因组序列相差很大,表明不是同一株病毒。在最初的发病鸡病料中存在两个病毒株,可能这两个病毒株在接种不同的宿主分别有不同的生长优势。病毒连续接种不同的宿主,其病毒毒力、嗜性和免疫原性等特性都会发生改变,将接种鸡胚尿囊腔的P1代的病毒分别接种SPF鸡胚和CEF连续传代,扩增传代过程中病毒的基因序列,判断两株病毒在鸡胚和CEF中传代的含量变化。分别分析测得的两株病毒的全基因序列,构建基因遗传进化树,毒株ck/CH/LSD/08-29属于基因Ⅱ型,毒株ck/CH/LSD/08-29(CEF)属于基因Ⅶ型。在CEF传代的优势毒株和5株水禽源的NDV亲缘关系最近,可能该毒株是从水禽体内传给鸡群的。而和在鸡胚中传代的优势毒株亲缘关系最近的NDV是一株人为的重组毒株,该重组毒株是以LaSota为载体,将一株基因Ⅶ型的NDV强毒株的F和HN基因替换LaSota毒株的F和HN基因,而且构建的毒株ck/CH/LSD/08-29各个基因的遗传进化树也显示毒株的F和HN基因和强毒株的亲缘关系最近,而NP和P基因和弱毒株的亲缘关系较近,该毒株可能是一株重组的病毒,有待进一步研究。设计6对鉴定特异性引物检验病毒在鸡胚和鸡胚成纤维细胞中传代的含量变化发现病毒在CEF中传代到P6代次时,尿囊液中的优势毒株ck/CH/LSD/08-29消失,在鸡胚尿囊液中传代到P11代次时CEF中的优势毒株ck/CH/LSD/08-29(CEF)消失。比对两株病毒的氨基酸序列发现HN蛋白序列相同,而NP、P和L蛋白的氨基酸差异较大,可能NDV的宿主嗜性除了与HN蛋白有关外还与此3种蛋白存在一定的相关性,说明NDV的嗜性可能是多基因相互作用的结果。本研究扩增了两株NDV的全基因组序列丰富了新城疫病毒的生物学信息数据库,比较了两株病毒在鸡胚尿囊腔中和CEF中传代含量变化并初步分析NDV在不同宿主适应的优势与基因的关系。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-15
第一章绪论  15-26
  1.1 新城疫的概述  15
  1.2 新城疫病毒的分子生物学研究进展  15-21
    1.2.1 NDV 生物学特性  15-17
    1.2.2 NDV 的基因组及编码的蛋白的生物学特性  17-20
    1.2.3 新城疫病毒的复制  20
    1.2.4 病毒在宿主中的传代  20-21
  1.3 新城疫的诊断  21-22
  1.4 新城疫病毒的免疫和防治  22-23
  1.5 新城疫的流行  23-24
    1.5.1 国外新城疫的流行情况  23
    1.5.2 国内新城疫的流行情况  23-24
  1.6 实时荧光定量PCR 技术  24-25
  1.7 研究目的和意义  25-26
第二章材料和方法  26-38
  2.1 实验材料  26-28
    2.1.1 病料来源  26
    2.1.2 SPF 鸡胚、SPF 鸡和鸡外周血红细胞  26
    2.1.3 主要试剂  26
    2.1.4 实验仪器  26-27
    2.1.5 引物  27-28
  2.2 实验方法  28-38
    2.2.1 病毒的分离鉴定  28-29
    2.2.2 血凝试验(HA)血凝抑制试验(HI)  29-30
    2.2.3 病毒 RNA 的提取和反转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)  30
    2.2.4 3′RACE 和5′RACE  30-32
    2.2.5 琼脂糖凝胶电泳鉴定  32
    2.2.6 全基因组的拼接比较分析  32-33
    2.2.7 病毒半数感染量(EID50)的测定  33
    2.2.8 病毒在SPF 鸡胚中的传代培养  33
    2.2.9 动物实验  33
    2.2.10 原代鸡胚成纤维细胞(CEF)的制作  33-34
    2.2.11 鸡胚成纤维细胞的传代  34
    2.2.12 第一代尿囊液病毒在鸡胚成纤维细胞的噬斑纯化  34
    2.2.13 挑取噬斑扩增病毒  34
    2.2.14 5 个病毒克隆株的全基因组序列测定及比对分析  34-35
    2.2.15 病毒在鸡成纤维细胞中的传代培养  35
    2.2.16 第一代在鸡胚成纤维细胞中传代病毒的部分基因序列的测定  35
    2.2.17 荧光定量PCR 检测两株不同病毒在CEF 传代中的病毒载量变化  35-37
    2.2.18 鉴别在SPF 鸡胚和CEF 传代的两株优势毒株的病毒含量变化  37-38
第三章实验结果  38-54
  3.1 病毒的分离与鉴定  38
  3.2 半数感染量的测定(EID50)  38-39
  3.3 动物实验  39-40
  3.4 基因片段的克隆  40
  3.5 PCR 产物的序列测定和全基因序列的拼接  40-42
  3.6 ck/CH/LSD/08-29 F 基因的序列分析及基因进化树的构建  42-43
  3.7 ck/CH/LSD/08-29 HN 基因的序列分析  43-44
  3.8 尿囊液病毒的噬斑纯化  44
  3.9 病毒克隆株的扩大培养  44
  3.10 病毒在CEF 噬斑纯化的5 个克隆株的全基因组序列的测定比对分析  44
  3.11 噬斑纯化的病毒株ck/CH/LSD/08-29(CEF)和尿囊腔接种的病毒株ck/CH/LSD/08-29 全基因组序列比较分析  44-46
  3.12 经过 CEF 噬斑纯化的病毒克隆株 ck/CH/LSD/08-29(CEF)的开放读码框的预测  46-47
  3.13 尿囊液优势病毒株ck/CH/LSD/08-29和CEF优势病毒株ck/CH/LSD/08-29(CEF)与新城疫病毒各代表毒株的全基因序列和各个基因构建的遗传进化树及同源性分析  47-49
  3.14 病毒在单层CEF 传代  49
  3.15 病毒在SPF 鸡胚的传代培养  49
  3.16 在CEF 中传代的第一代次的病毒的部分序列测序结果  49
  3.17 克隆株病毒 ck/CH/LSD/08-29(CEF)HN 蛋白氨基酸(1-80 位点)与其他 NDV代表毒株氨基酸序列比对  49-50
  3.18 利用6 对鉴定引物扩增在SPF 鸡胚和CEF 中传代的各个代次病毒的PCR 结果  50-52
  3.19 利用荧光定量检测两株病毒株在CEF 传代中的含量变化  52-54
第四章讨论  54-57
  4.1 病毒的分离和鉴定  54
  4.2 尿囊液病毒株ck/CH/LSD/08-29 的全基因组的序列分析  54
  4.3 经过CEF 噬斑纯化的病毒克隆株ck/CH/LSD/08-29(CEF)序列分析  54-55
  4.4 混合病毒接种SPF 鸡胚和CEF 传代的变化  55-57
第五章全文结论  57-58
参考文献  58-66
致谢  66-67
作者简介  67

两株新城疫病毒分离株全基因组序列的测定及在CEF和鸡胚传代的含量变化分析

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