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松材线虫纤维素酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达、纯化和性质研究

作　者: 任慧杰
导　师: 郭道森
学　校: 青岛大学
专　业: 微生物学
关键词: 松材线虫纤维素酶基因克隆活性
分类号: S763.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

采用PCR技术扩增了松材线虫纤维素酶的编码基因,克隆基因与已报道的纤维素酶BXC10基因的同源性高达99%。将其克隆到组成型表达载体pET-15b上构建pET-15b-BXC,并将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株构建工程菌,SDS-PAGE分析表明,IPTG诱导了纤维素酶在工程菌中表达。采用Ni2+-NTA树脂和阴离子(DEAE)交换树脂对重组蛋白分离纯化,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其纯化程度,DNS法测定其纤维素酶的活性及其最适温度、最适pH和其热稳定性、pH稳定性。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,亲和层析后重组蛋白质的纯度为50%左右,经阴离子(DEAE)交换树脂分离纯化后,只得到均一的一条带,大小为40 kDa。活性分析表明工程菌表达的重组蛋白具有纤维素酶活性,其最适温度为45℃,最适pH为40。实验结果还证明该蛋白具有很好的热稳定性：不同温度处理1h后,该蛋白在45℃-65℃范围内可保持70%以上的纤维素酶酶活力,70℃以后,其纤维素酶酶活力下降迅速,80℃时其纤维素酶酶活力几乎完全丧失,45℃时剩余纤维素酶酶活最高,可达98%；该蛋白pH稳定性也很好：其纤维素酶酶活在pH3.0-5.0范围内其酶活稳定性逐步上升,并在pH5.0时酶活稳定性达到最高。本实验结果可为进一步研究松材线虫纤维素酶在松萎蔫病中的作用奠定基础。

全文目录

摘要  2-3
Abstract  3-6
引言  6-8
第一章材料与方法  8-17
  1.1 实验材料  8
    1.1.1 菌株、质粒和培养条件  8
    1.1.2 主要试剂  8
  1.2 方法  8-17
    1.2.1 松材线虫的来源  8
    1.2.2 无菌松材线虫的获得  8-9
    1.2.3 松材线虫cDNA文库的构建  9
    1.2.4 序列测定及分析  9
    1.2.5 松材线虫纤维素酶基因的克隆  9-13
      1.2.5.1 引物设计  9
      1.2.5.2 PCR  9-10
      1.2.5.3 目的片段回收  10-11
      1.2.5.4 PCR片段与pMD18-T载体连接  11
      1.2.5.5 将含目的基因的连接载体(pMD18-T-BXC)转化到大肠杆菌体内  11-12
      1.2.5.6 重组质粒的酶切鉴定  12
      1.2.5.7 菌落PCR鉴定  12-13
      1.2.5.8 测序鉴定  13
    1.2.6 松材线虫纤维素酶的DNA序列分析  13-14
      1.2.6.1 重组质粒的酶切鉴定  13
      1.2.6.2 菌落PCR鉴定  13
      1.2.6.3 工程菌的构建及目的基因测序  13-14
    1.2.7 含松材线虫纤维素酶基因原核表达载体的构建  14
    1.2.8 重组纤维素酶的诱导表达  14
    1.2.9 重组蛋白的纯化  14-15
      1.2.9.1 重组蛋白的初步纯化—亲和层析  14-15
      1.2.9.2 透析  15
      1.2.9.3 阴离子(DEAE)交换层析  15
    1.2.10 酶学活性测定  15-17
      1.2.10.1 葡萄糖标准曲线绘制  15-16
      1.2.10.2 松材线虫纤维素酶的活性分析  16
      1.2.10.3 松材线虫纤维素酶最适温度的测定  16
      1.2.10.4 松材线虫纤维素酶最适pH的测定  16
      1.2.10.5 酶反应的热稳定性  16
      1.2.10.6 酶反应的pH稳定性  16-17
第二章实验结果  17-30
  2.1 松材线虫纤维素基因的PCR扩增  17-23
    2.1.1 松材线虫纤维素酶基因的克隆  17
    2.1.2 重组质粒的酶切鉴定  17-18
    2.1.3 菌落PCR鉴定  18-19
    2.1.4 松材线虫纤维素酶基因cDNA编码区的序列分析  19-21
    2.1.5 以松材线虫基因组为模板的PCR结果  21-22
    2.1.6 重组质粒pMD18-T-BXC46’酶切鉴定结果  22-23
    2.1.7 纤维素酶基因(BXC46’)的DNA序列测定结果  23
  2.2 含松材线虫纤维素酶基因原核表达载体的构建  23-24
  2.3 重组纤维素酶的表达与部分纯化  24-25
  2.4 重组纤维素酶的纯化  25-27
    2.4.1 亲和层析结果  25-26
    2.4.2 阴离子交换层析结果  26-27
  2.5 松材线虫纤维素酶酶学活性  27-30
    2.5.1 葡萄糖标准曲线绘制  27-28
    2.5.2 松材线虫纤维素酶的最适温度及最适pH  28
    2.5.3 松材线虫纤维素酶的热稳定性及pH稳定性  28-30
结论  30-31
讨论  31-32
参考文献  32-35
综述  35-50
  综述参考文献  46-50
攻读学位期间的研究成果  50-51
附录  51-56
致谢  56-57

松材线虫纤维素酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达、纯化和性质研究

内容摘要

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