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压力调控成体干细胞复合PRF所构建双膜复合体成软骨能力的体外实验研究

作　者: 陈慧
导　师: 陈永进
学　校: 第四军医大学
专　业: 口腔医学
关键词: 压力骨髓间充质干细胞脂肪干细胞富血小板纤维蛋白成软骨
分类号: R318.08
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

关节软骨因本身无血管、淋巴、神经组织，一旦损伤，其自身的修复能力极其有限，容易导致骨性关节炎的发生，因此，临床上一直在探求获得功能性软骨再生修复的治疗方法。近些年来，随着组织工程技术的不断发展，为临床上治疗软骨损伤提供了新的研究思路。种子细胞、生长因子及支架材料作为软骨组织工程中的三大要素，其各自均发挥着极其重要的作用。在种子细胞选择上，骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）和脂肪干细胞（Adipose-derivedstem cells，ADSCs）作为成体干细胞中重要的两大类干细胞，因其具有较强的自我增殖能力和多向分化潜能，均被广泛的用于软骨组织工程的研究，但两者之间在相同的培养环境下，成软骨的能力是否存在差异却尚不明确。在生长因子来源方面，由于外源性生长因子的供给，存在较短的半衰期及费用较高等，常给临床应用带来不便；富血小板纤维蛋白（Platelet-rich fibrin，PRF）的出现就很好的解决了这一难题，PRF为高度浓缩的血小板衍生物，来源于自体全血，具有能缓慢释放多种复合比例的生长因子、价格低廉、应用方便、可作为支架材料等特点且已被大量用于临床和实验的研究。我们了解到，通过将体外培养的细胞接种于特定的生物支架材料，然后进行体内移植达到组织再生修复的传统方法，存在细胞量的流失以及移植区的炎症反应等问题；而细胞膜片技术的研发为这些问题的解决开辟了新的途径，它不仅能够保留大量的细胞，而且能够储存丰富的细胞外基质及减轻移植区术后的炎症反应，故在组织工程中具有广阔的应用前景。然而，诸多研究发现，常规体外静态培养系统所形成的组织工程软骨在行使正常功能方面尚存在不足，并且压力作为软骨发生、发育及改建中的重要因素以及在软骨再生中的作用已逐渐被关注和重视，但是目前大多数关于软骨组织工程的研究却热衷于干细胞生长与分化的化学以及生长因子环境的调控方面的研究，而对干细胞在力学环境调控下成软骨的效应研究却较少见报道。因此，本实验通过采用成体干细胞膜片与同体PRF膜复合构建一种新型的组织工程移植物，采用可控细胞液压加载装置对其施以静态压力刺激以模拟细胞在体时的关节内力学微环境，探究压力调控对成体干细胞复合PRF双膜复合体体外成软骨能力的影响，并比较BMSCs和ADSCs两种干细胞的体外成软骨效应，为提高组织工程软骨的质和量提供新的研究思路以及为软骨组织工程筛选优质的种子细胞以用于临床软骨再生修复提供实验理论依据。本实验分为4个部分。第一部分为兔BMSCs膜复合同体PRF双膜结构复合体的构建与鉴定。雄性新西兰大白兔2只，3-4月龄，采用密度梯度离心法培养兔的BMSCs，流式细胞仪行表面标记分子的检测以及成骨及成脂诱导分化鉴定，膜片诱导液诱导成膜并将其制成膜片片段。取兔耳廓中动脉全血10ml，3000r/min，10min离心获得PRF，将PRF压制成膜并将其剪成颗粒，与BMSCs细胞膜片片段按一定的比例手动混匀，加入适量α-MEM培养液，置于培养皿中培养4天后取材。扫描电镜观察双膜复合体特点，结果显示：BMSCs细胞通过伸出的伪足嵌入到PRF膜网孔状结构内的方式使两者能够较好的结合，从而形成一个整体；MTT法检测双膜复合体中BMSCs增殖情况，结果显示：在有PRF作用组的BMSCs细胞增殖速度明显要强于无PRF组；ELISA法检测双膜复合体中PRF的生长因子释放情况，结果显示：各种生长因子随着时间的延长，其浓度逐渐降低，但降低的速度较为缓慢。在第一部分实验的基础上，我们进行了第二部分实验即探究压力对BMSCs/PRF双膜复合体中BMSCs的增殖及软骨向分化的影响。采用自行研制的液态静压加载装置设定给予双膜结构不同程度的压力刺激，在90KPa、120KPa、150KPa压力条件下分别加载1h/d、6h/d，将双膜复合体放置在加压装置内分别静置1h/d和6h/d为对照组，在连续加载的第2、4、6天终止培养、取材， Real-time PCR法检测PCNA，Sox-9，Aggrecan，Col-II基因的表达水平。Real-time PCR结果显示：实验所设定的各组压力刺激条件均可在BMSCs产生显著的促增殖效应，其中以120KPa/1h/4d的压力条件下PCNA基因表达水平最高。2d压力刺激明显上调Aggrecan水平，而对Sox-9与Col-II的表达无显著作用；4d压力刺激可同时促进Aggrecan、Sox-9与Col-IImRNA的合成，其中以120KPa、1h/d、持续4d的压力条件下的成软骨基因表达水平最高；6d压力刺激下仅在90KPa、120KPa加压1h时表现出对Col-II mRNA的促进作用。同时，各加压组的基因表达量均在4d时达到高峰，在6d时则开始下降，相同的加压组在1h与6h间并无显著性差异。鉴于120KPa/1h/d持续4d的压力刺激为最适压力加载方式，进一步观察这种压力刺激对BMSCs/PRF双膜复合体超微结构的影响。将BMSCs膜片随机分为4组即：BMSCs细胞膜组、BMSCs/PRF双膜组、BMSCs细胞膜+压力组、BMSCs/PRF双膜+压力组，分别于4d后取材。压力为120KPa/1h/d的压力刺激，采用透射电镜和扫描电镜分别观察在适宜的压力刺激下双膜复合体中BMSCs细胞内部超微结构的改变及细胞膜片表面结构的变化。结果显示：在压力刺激组中BMSCs的内质网呈扩张状态，其中BMSCs/PRF双膜+压力组的内质网扩张程度最为显著，而不加压组的BMSCs细胞内质网均呈相对闭锁状态；同时，加压组的BMSCs细胞膜片表面可见颗粒状分泌物及网状的胶原纤维分布，其中BMSCs/PRF双膜+压力组细胞膜片表面颗粒状分泌物和胶原纤维最为显著，而不加压组的BMSCs细胞膜片表面较为光滑未见明显分泌物和胶原纤维。在第三部分实验中，我们试图利用来源更容易的兔ADSCs，构建ADSCs/PRF双膜复合体，观察压力调控对其成软骨能力的影响并与BMSCs进行比较，探究ADSCs能否真正取代BMSCs用于组织工程软骨的构建。采用组织块法培养兔的ADSCs，流式细胞仪行表面标记分子的检测以及成骨及成脂诱导分化鉴定，膜片诱导液诱导成膜并将其剪成膜片片段。取兔耳廓中动脉全血10ml，3000r/min，10min离心获得PRF，将PRF压制成膜并剪成颗粒状，鉴于BMSCs/PRF双膜复合体的构建方法构建ADSCs/PRF双膜复合体。将ADSCs细胞膜片随机分为4组：ADSCs细胞膜组、ADSCs/PRF双膜组、ADSCs细胞膜+压力组、ADSCs/PRF双膜+压力组，压力刺激为120KPa/1h/d，分别于4d后取材，采用透射电镜观察ADSCs超微结构的变化，Real-time PCR检测各组PCNA，Sox-9，Aggrecan，Col-II基因的表达水平。结果显示：压力刺激对各组ADSCs膜细胞内部内质网并未产生明显影响；基因检测各组ADSCs的PCNA.、Aggrecan及Col-II的mRNA的表达均在2d时达到最高，各处理组间相比，在PCNA、Aggrecan及Col-II的表达上均无显著性差异，仅在Sox-9的表达上，各实验组的表达量均高于对照组即单纯的ADSCs膜片组。将以上各基因表达结果与相应的BMSCs各组基因表达水平相比，结果显示：BMSCs膜在有无压力或PRF的作用下，其PCNA，Sox-9，Aggrecan，Col-II基因的mRNA表达量均要显著高于相应的ADSCs膜组。在前三部分实验的基础之上，实验的第四部分为基于BMSCs/PRF双膜复合体的组织工程软骨的构建及观察压力对构建软骨的影响。采用三层BMSCs细胞膜片叠加复合一层PRF膜形成一个组织团块，并将组织团块随机分为4组即：BMSCs复合PRF团块组、BMSCs复合PRF团块+压力刺激组、BMSCs复合PRF团块+软骨诱导组、BMSCs复合PRF团块+软骨诱导组+压力刺激组，压力刺激采用120KPa/1h/d，软骨诱导为使用成软骨诱导液培养组织团块，分别于2周、4周后取材。运用组织学HE和甲苯暗蓝染色法观察团块组织形态学的变化。结果显示：经过4周的培养，每天给予压力刺激组的团块表面均可见软骨细胞和软骨基质分布，其中又以软骨诱导和压力刺激同时给予组的软骨细胞和软骨基质分泌量最多，而仅培养2周的团块均未见明显的软骨细胞和软骨基质形成。实验结论：1.利用BMSCs细胞膜片片段按适宜比例复合自体PRF膜颗粒可构建一种新型的组织工程移植物，这种移植物可以为BMSCs细胞的生长提供基质和生长因子双重支持的微环境，具有较好的生物学特性。2.压力刺激可明显促进BMSCs/PRF双膜复合体中BMSCs的增殖与软骨向分化能力，以120KPa每天静压1h连续4天的刺激对BMSCs增殖和成软骨分化的促进作用最强，为BMSCs/PRF双膜复合体体外成软骨分化的最适压力加载方式，在此压力刺激下，可通过刺激细胞内内质网的扩张，激活相关细胞器，从而促进蛋白及多糖类大分子物质的合成，而无压力作用组却无此现象。3.相同的压力作用对ADSCs膜复合同体PRF膜双膜复合体的增殖和成软骨能力的作用不及相应的BMSCs显著，相同的培养环境下，BMSCs膜的体外成软骨能力明显强于ADSCs。4.利用三层BMSCs细胞膜片复合同体PRF膜的复合体，每天120KPa/1h的压力刺激或提供成软骨诱导的培养环境，4周后可见软骨团块形成，单纯的压力刺激可以取代成软骨诱导液的作用；但如果在软骨诱导的同时给予适宜的压力刺激则可提高组织工程软骨的质量，而如果既不给予压力加载又无软骨诱导的环境下，BMSCs/PRF双膜复合体体外培养4周并不能形成软骨团块。

压力调控成体干细胞复合PRF所构建双膜复合体成软骨能力的体外实验研究

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