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基于纳米胶束的Micelleplex输送小干扰RNA用于癌症治疗

作　者: 毛成琼
导　师: 王均
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 生物材料
关键词: 癌症治疗 Micelleplex siRNA药物 合成致死 KRAS突变 乳腺癌 非小细胞肺癌 药物输送
分类号: R318.08
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


癌症是危害人类生命健康的重大疾病之一,放疗和化疗均存在不可忽略的副作用,基于小干扰RNA (siRNA)的核酸类药物为癌症的治疗带来了新的可能。选取合适的靶基因,将针对该基因的siRNA导入肿瘤细胞中,下调其表达,可以安全有效地抑制肿瘤生长。另一方面,由于并不是所有看似“完美”的靶基因都能够通过siRNA直接沉默,当直接干扰其表达存在障碍时,可以绕开目的基因,对其合成致死相关基因进行干扰,在不损伤正常细胞的前提下,达到治疗效果。本论文发展基于纳米胶束的micelleplex载药系统,输运siRNA治疗癌症,探索siRNA药物抗肿瘤治疗方案。在前一部分,论文利用官能化的聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯三嵌段共聚物(mPEG-b-PCL-b-PPEEA)形成的胶束纳米颗粒,制备micelleplex,携载针对酸性神经酰胺酶的siAC,经系统给药后,将siAC输送至荷瘤小鼠的肿瘤细胞中,显著抑制了乳腺肿瘤的生长,为乳腺癌的治疗提供了新方法。在论文的后一部分,在KRAS突变的非小细胞肺癌肿瘤模型中,绕开了难以直接靶向的KRAS基因,利用KRAS与CDK4基因之间的合成致死效应,使用携载有针对CDK4siRNA (siCDK4)的混合胶束颗粒对荷瘤小鼠进行治疗。结果显示,携载有siCDK4的micelleplex对KRAS突变的肿瘤生长有显著抑制效果,而对正常细胞或KRAS野生型肿瘤的生长影响不明显,从而提供了可用于KRAS突变肿瘤的治疗方案。同时,研究结果提示,基于合成致死效应的RNA干扰治疗手段,不仅可有效杀伤目标肿瘤细胞,而且对正常组织和细胞不造成明显影响。本论文的主要研究内容和结论如下：(1)构建了基于mPEG-b-PCL-b-PPEEA三嵌段两亲性阳离子聚合物的micelleplex,可有效携载siRNA进入乳腺癌细胞BT474中,并在细胞内有效释放siRNA,沉默目的基因表达。当该micelleplex携载针对酸性神经酰胺酶基因的siAC进入BT474细胞后,诱发肿瘤细胞凋亡。在体内研究中,通过系统给药,给原位接种BT474乳腺癌的小鼠注射携载siAC的micelleplex,显著抑制肿瘤生长,研究结果进一步显示上述micelleplex输送siAC,有效抑制了酸性神经酰胺酶在肿瘤的表达。此研究证实了基于RNA干扰的micelleplex用于乳腺癌治疗的有效性和可行性。(2)利用两种嵌段共聚物PCL29-b-PPEEA21和PCL40-b-PEG45制备了混合胶束纳米颗粒,并进一步制备了携载siRNA的micelleplex。研究应用合成致死原理,研究了一种针对KRAS基因突变的肿瘤治疗方案。由于CDK4基因与KRAS基因之间存在合成致死效应,在KRAS基因突变的非小细胞肺癌细胞(NSCLC)中抑制CDK4基因表达可导致肿瘤细胞的凋亡。在体外研究中,我们利用混合胶束纳米颗粒制备的micelleplex携载siCDK4,转染KRAS突变的NSCLC细胞及KRAS野生型的细胞,发现CDK4的表达均被下调。然而,随着CDK4表达的下降,仅KRAS突变的NSCLC细胞增殖受到抑制,KRAS野生型的NSCLC细胞以及正常人肝细胞的生长增殖均影响不明显。同时,构建了小鼠的KRAS突变型以及KRAS野生型的NSCLC细胞皮下植入肿瘤模型,通过尾静脉注射携载有siCDK4的micelleplex进行治疗,发现仅KRAS突变的肿瘤生长被有效抑制,KRAS野生型的肿瘤生长则没有受到显著影响,证实该治疗方案的特异性、高效性和安全性,为开发siRNA药物提供了新的策略。

全文目录


摘要  5-7
ABSTRACT  7-13
第一章 绪论  13-39
  1.1 癌症临床治疗现状及其瓶颈  13-14
  1.2 RNA干扰类药物在肿瘤治疗中的应用及面临的问题  14-18
  1.3 纳米药物载体携载小干扰RNA用于肿瘤治疗  18-24
    1.3.1 脂质类纳米载体  19-21
      1.3.1.1 脂质体/脂质复合物  19-20
      1.3.1.2 稳定的核苷酸脂质颗粒(stable nucleic acid lipid particle,SNALP)  20-21
    1.3.2 聚合物类纳米载体  21-23
      1.3.2.1 基于环糊精的纳米颗粒  21
      1.3.2.2 基于壳聚糖的纳米颗粒  21
      1.3.2.3 基于PEI的纳米颗粒  21-22
      1.3.2.4 基于PLGA的纳米颗粒  22
      1.3.2.5 基于树枝状大分子的纳米颗粒  22-23
    1.3.3 siRNA键合物  23
    1.3.4 siRNA输送体系的选择  23-24
  1.4 RNA干扰靶点选择  24-26
  1.5 选题依据  26-29
  参考文献  29-39
第二章 基于阳离子型三嵌段共聚物的Micelleplex输送小干扰RNA用于癌症治疗  39-65
  2.1 引言  39-40
  2.2 实验材料  40-42
    2.2.1 主要材料  40
    2.2.2 细胞株  40-41
    2.2.3 主要药品及试剂  41-42
  2.3 实验方法  42-49
    2.3.1 胶束纳米颗粒(MNPs)的制备  42
    2.3.2 动态光散射检测胶束纳米颗粒的粒径分布及表面电位  42
    2.3.3 琼脂糖凝胶阻滞实验检验胶束纳米颗粒结合siRNA的能力  42-43
    2.3.4 细胞的传代培养  43
    2.3.5 负载cy3-siRNA的纳米颗粒细胞内在化能力的研究  43
    2.3.6 荧光素酶报告基因检测胶束纳米颗粒输送siRNA沉默目的基因的能力  43-44
    2.3.7 PCR检测micelleplex_(siAC)对BT474细胞中AC mRNA表达的影响  44-45
    2.3.8 Western Blot检测micelleplex_(siAC)对BT474细胞中AC蛋白表达的影响  45-46
    2.3.9 检测micelleplex_(siAc)诱导BT474细胞产生凋亡  46
    2.3.10 克隆形成实验检测micelleplex_(siAC)对BT474细胞增殖的影响  46
    2.3.11 Micelleplex_(siAC)对乳腺癌细胞中凋亡相关蛋白表达的影响  46-47
    2.3.12 BT474原位肿瘤模型建立  47
    2.3.13 乳腺癌原位肿瘤的治疗及肿瘤体积测量  47
    2.3.14 肿瘤组织中的AC表达水平的检测  47-48
    2.3.15 TUNEL法检测肿瘤组织中细胞凋亡的情况  48
    2.3.16 BrdU染色检测肿瘤组织中细胞的增殖情况  48
    2.3.17 酶联免疫吸附实验(ELISA)检测荷瘤裸鼠血清中的免疫因子表达水平  48-49
  2.4 结果与讨论  49-59
    2.4.1 胶束纳米颗粒能有效携载siRNA  49-51
    2.4.2 胶束纳米颗粒可以携载siRNA进入肿瘤细胞  51
    2.4.3 Micelleplex_(siAC)下调报告基因Luciferase的表达  51-53
    2.4.4 Micelleplex_(siAC)下调内源性基因酸性神经酰胺酶的表达  53-54
    2.4.5 Micelleplex_(siAC)介导乳腺癌细胞的凋亡  54-55
    2.4.6 Micelleplex_(siAC)有效抑制原位乳腺癌小鼠肿瘤的生长  55-57
    2.4.7 Micelleplex_(siAC)下调肿瘤内源性基因AC的表达  57
    2.4.8 免疫组化观察治疗结束后肿瘤的增殖水平以及凋亡水平  57-58
    2.4.9 Micelleplex_(siAC)不引起天然免疫反应  58-59
  2.5 本章小结  59-60
  参考文献  60-65
第三章 混合胶束纳米粒制备的Micelleplex输送siRNA用于非小细胞肺癌的合成致死治疗  65-89
  3.1 引言  65-67
  3.2 实验材料  67-69
    3.2.1 主要材料  67-68
    3.2.2 细胞株  68
    3.2.3 主要药品及试剂  68-69
  3.3 实验方法  69-74
    3.3.1 胶束纳米颗粒(MNP)的制备  69
    3.3.2 动态光散射检测胶束纳米颗粒的粒径分布及表面电位  69
    3.3.3 琼脂糖凝胶电泳实验检验胶束纳米颗粒与siRNA的结合能力  69-70
    3.3.4 细胞的传代培养  70
    3.3.5 Realtime PCR检测MNP_(siCDK4)对不同细胞系中CDK4 mRNA表达的影响  70-71
    3.3.6 Western Blot检测MNP_(siCDK4)对各细胞中CDK4蛋白表达的影响  71
    3.3.7 克隆形成实验检测MNP_(siCDK4)对细胞增殖的影响  71
    3.3.8 MTT实验检测MNP_(siCDK4)对各细胞的杀伤效果  71-72
    3.3.9 细胞共培养实验检测MNP_(siCDK4)对KRAS突变细胞的选择性杀伤作用  72
    3.3.10 A549、H226皮下肿瘤模型的建立  72-73
    3.3.11 非小细胞肺癌肿瘤的治疗及肿瘤体积测量  73
    3.3.12 肿瘤组织中的CDK4表达水平的检测  73-74
    3.3.13 Western blot检测肿瘤组织中KRAS的表达情况  74
    3.3.14 Ki-67染色检测肿瘤组织中细胞的增殖情况  74
  3.4 结果与讨论  74-83
    3.4.1 混合胶束纳米颗粒能够有效携载siRNA  74-76
    3.4.2 胶束纳米颗粒输送siRNA显著下调细胞中CDK4基因的表达  76-77
    3.4.3 胶束纳米颗粒输送siCDK4特异性抑制KRAS突变细胞活力  77-78
    3.4.4 胶束纳米颗粒输送siCDK4特异性抑制KRAS突变细胞增殖  78-79
    3.4.5 MNP_(siCDK4)可特异性抑制KRAS突变非小细胞肺癌肿瘤的生长  79-81
    3.4.6 MNP_(siCDK4)下调肿瘤内源性基因CDK4的表达  81-83
    3.4.7 免疫组化观察治疗结束后肿瘤的增殖水平以及凋亡水平  83
  3.5 本章小结  83-85
  参考文献  85-89
附录一 主要仪器设备  89-91
附录二 常规试剂  91-93
附录三 主要溶液配制  93-97
附录四 常规实验方法  97-103
致谢  103-104
在读期间发表的学术论文与取得的研究成果  104-106

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医用一般科学 > 生物医学工程 > 一般性问题 > 生物材料学
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