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钾通道开放剂C15对KCNQ电流的影响

作　者: 赵倩
导　师: 贾庆忠
学　校: 河北医科大学
专　业: 药理学
关键词: M通道 C15 DRG
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

KCNQ基因编码的离子通道属于电压依赖性钾通道Kv7家族，目前发现KCNQ1～KCNQ5五个成员，其中KCNQ2和KCNQ5分别与KCNQ3形成的杂合体是构成神经系统M通道分子基础，所记录的电流称为M样电流（Im），具有慢激活、非失活、电压依赖特征，由于该通道在神经阈电位附近开放，对神经动作电位的发放影响较大，尤其是在维持神经细胞兴奋性、静息膜电位、突触递质释放等许多神经活动方面扮演重要的角色。而调节该类通道也成为治疗癫痫、惊厥、病理性神经疼痛等多种神经性疾病一个重要途径。双氯芬酸（Diclofenac）、氟吡汀（Flupirtine）作为非阿片类镇痛药能明显增强KCNQ电流。瑞替加滨（Retigabine）是一个选择性较高的KCNQ通道开放剂，可用于癫痫部分发作的辅助治疗。C15是经高通量筛选发现的一个活性化合物，结构比较新颖，对KNQ2/3通道有良好地开放活性。本文在此基础上对C15调节KCNQ通道的特征、规律以及可能的机制进行了探讨，以期为开发成新药提供有价值的实验数据。目的：通过在表达系统和原代培养细胞上用全细胞膜片钳技术记录KCNQ/M型电流，观察化合物C15对KCNQ/M通道的调节特征和规律；利用电流钳技术在原代培养的神经元，背根神经节（DRG）细胞上观察C15对动作电位的影响，分析C15对神经兴奋性的调节作用。方法：(1)通道表达：利用分子生物学方法将KCNQ通道基因克隆在pcDNA3.0质粒载体上，报告基因GFP克隆在pEGFP-N1质粒上，用TOP10感受态细菌转化、扩增之后用试剂盒提取，并用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计鉴定质粒的纯度与浓度。在HEK293B细胞上，KCNQ2、KCNQ3及GFP质粒共转染，在倒置荧光显微镜上用450～490nm（蓝光）激发观察通道表达情况。(2)电流记录：利用Axon700B膜片钳系统，在HEK293表达体系用两性霉素B为打孔剂，全细胞电压钳方式记录KCNQ电流；在原代培养的DRG神经元，以吸破的全细胞膜片钳方式记录M电流，观察化合物C15对KCNQ2/3电流和M电流的调节作用。(3)动作电位记录：利用Axon700B膜片钳系统，在DRG神经元上用电流钳的方式，记录DRG神经元膜电位和动作电位，观察C15和工具药XE991对二者的影响。结果：(1)质粒提取与鉴定结果：克隆在pcDNA3.0(5.4Kbp)载体上的KCNQ质粒电泳条带和绿色荧光蛋白pEGFP-N1(4.8Kbp)质粒的电泳条带均在5000bp左右。ND-1000紫外/可见光分光光度计测得质粒DNA的浓度值，其中KCNQ浓度均在200~500ng/μL之间，GFP均在200~500ng/μL之间；OD260/OD280值均在1.8~1.9之间。(2)化合物C15浓度依赖性增强KCNQ2/3通道电流：当给予10μmolC15引起KCNQ2/3通道激活电流和去活电流均明显增大。继而给予不同浓度的C15溶液（0.01μmol～60μmol）记录，以浓度为横坐标，电流变化值为纵坐标，采用logistic方程进行拟合，得到其量效关系曲线，半数有效量EC50为0.59±0.03μmol（n=8）。(3)化合物C15可浓度依赖性增强KCNQ2/3通道激活电压：将不同激活电压下所得到的去活尾电流统一进行标准化，拟合得到KCNQ2/3通道I-V曲线图。给予0.04，0.2，1，5，20μmol不同浓度C15后，通道激活电压逐渐向超极化方向移。以C15的浓度为横坐标，V变化量为纵坐标绘制的量效关系曲线，用Boltzmann方程拟合，得EC50值为0.8±0.1μmol。(4)化合物C15对KCNQ2/3通道动力学特征的影响：用单指数方程对通道激活和去活电流拟合得到一个衡量通道开放快慢的时间参数（tau值，τ），统计得到C15（20μmol）能显著延长通道激活和去活时间参数（P<0.05，n=5），。(5)化合物C15对不同亚型KCNQ通道的选择性：C15（1μmol）可不同程度增强KCNQ1，KCNQ2，KCNQ4，KCNQ5，KCNQ2+3通道电流。并且使各通道激活曲线向超极化方向移动。C15对KCNQ3通道作用不明显，但对KCNQ2/3杂合通道影响较大。C15对KCNQ通道动力学影响，主要表现：可延长通道激活和去活时程，但对去活时间常数的影响比激活时间常数更明显。尤其是对KCNQ1、KCNQ2和KCNQ2/3的影响最明显。(6)化合物C15对KCNQ2通道不同突变体的影响：C15（1μmol）对KCNQ2两个突变体KCNQ2(R207W)、KCNQ2（A306T）有明显的调节作用，但对另外一种KCNQ2突变体（Y284C）的作用不明显。其1μmol，10μmolC15对KCNQ2（Y284C）通道V作用均不明显。(7) C15对大鼠背根神经节上M电流的影响：记录大鼠背根神经元上的M电流。C15（10μmol）能够显著增加M电流21%（n=8），但其作用要稍弱于对照药RTG（P>0.05，n=8）。C15还可以显著性导致背根神经元静息膜电位向超极化方向移动。给予XE991后基本可以消除C15引起的细胞静息膜电位变化。另一方面，C15可以减弱簇状神经元动作电位的爆发次数，显著降低神经元兴奋性。结论：（1） C15能够浓度依赖性增强KCNQ2/3电流，EC50为0.59±0.03μmol。C15使KCNQ2/3通道激活的I-V曲线向超极化电压方向移动，同时延长激活和去活的时间常数，影响通道动力学特征。（2） C15对KCNQ1，KCNQ2， KCNQ4，KCNQ5四个亚型钾通道均用调节作用，虽然对KCNQ3作用不明显但对KCNQ2/3杂合体蛋白通道作用明显。（3）C15增强大鼠背根神经元M电流，引发神经元静息膜电位向超极化方向移动，降低动作电位的爆发。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-11
英文缩写  11-12
前言  12-13
材料与方法  13-21
结果  21-25
附图  25-36
附表  36-38
讨论  38-40
结论  40-42
参考文献  42-45
综述  45-58
  参考文献  52-58
致谢  58-59
个人简历  59

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