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白内障致病基因HSF4与SNF8相互作用的鉴定

作　者: 刘雪雪
导　师: 刘木根
学　校: 华中科技大学
专　业: 遗传学
关键词: 先天性白内障 HSF4 SNF8 免疫组化免疫共沉淀
分类号: R776.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 2次
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内容摘要

先天性白内障是儿童致盲的主要原因之一，发病率大约为0.3-1.5/1000，近一半的先天性白内障是与遗传相关的，已经确定的可导致先天性白内障的有26个致病基因，以及大约40个可能的基因位点。在调控晶状体早起发育中，热休克转录因子4（HSF4）作为转录因子起到关键作用，位于DNA结合结构域的错义突变会导致先天性白内障。HSF4有HSF4a和HSF4b两种亚型。HSF4b缺失可下调鼠晶状体中热休克蛋白的表达，同时还会上调FGF家族成员的表达。然而，HSF4转录活性的具体分子机制尚不清楚，研究与HSF4相互作用的蛋白质对于建立HSF4相关蛋白的相互作用网络，以及这一转录因子是如何在晶状体发育中发挥作用的具有重要意义。本实验室前期工作中，通过酵母双杂交的方法发现可能与HSF4存在相互作用的蛋白质——SNF8。本文主要利用GST pull-down技术和免疫共沉淀技术这两种方法对酵母双杂交结果——HSF4与SNF8之间存在相互作用进行进一步验证。本实验中首先通过免疫组化发现SNF8在小鼠晶状体中表达，蛋白印迹分析发现其在人的晶状体上皮（HLE）细胞中表达。从HLE细胞cDNA文库中克隆得到SNF8基因全长，并将其编码序列插入真核表达载体p3×FLAG-CMV-7.1中，测序后转染HLE细胞进行表达；同时将重组的原核表达载体pGEX-6P-1-hsf4b转化到BL21大肠杆菌中，通过IPTG诱导，经过谷胱甘肽TM4B琼脂糖珠纯化后与含有上述外源表达SNF8蛋白质的细胞裂解液进行孵育，最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析发现HSF4b与SNF8之间存在相互作用。基于GST pull-down的结果，我们用免疫共沉淀的方法对HSF4b与SNF8之间的互作关系进行进一步验证分析。将真核表达质粒p3×FLAG-CMV-7.1-SNF8和pEGFP-Hsf4b-wt共同转入HLE细胞，48小时后裂解细胞，向裂解液中加入抗标签蛋白的抗体进行孵育，再与Protein A/G琼脂糖珠子孵育一段时间，洗涤洗脱后经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，表明HSF4b与SNF8之间确实存在相互作用。为揭示HSF4关键的功能元件，我们进一步通过系列缺失的方法，验证蛋白质HSF4b内部不同的结构域在这一相互作用过程中的意义，发现HSF4b的DBD结构域和HR A/B结构域对于HSF4b与SNF8之间的相互作用是至关重要的，而DHR结构域则对二者相互作用影响不大。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-9
1 前言  9-18
  1.1 先天性白内障研究进展  9-12
  1.2 HSF4 基因与先天性白内障  12-14
  1.3 SNF8 基因概述  14-15
  1.4 实验方法概述  15-18
2 材料与方法  18-37
  2.1 实验材料  18-25
  2.2 实验方法及步骤  25-37
3 结果与讨论  37-44
  3.1 实验结果  37-41
  3.2 讨论  41-44
4 总结和展望  44-46
致谢  46-48
参考文献  48-53

白内障致病基因HSF4与SNF8相互作用的鉴定

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