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脐带血CD34+细胞来源的树突状细胞功能活性研究

作　者: 李康
导　师: 蔡建辉
学　校: 河北医科大学
专　业: 外科学
关键词: 脐带血 CD34+细胞 树突状细胞 细胞因子 细胞毒性T淋巴细胞 肿瘤杀伤
分类号: R730.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要


目的：探讨脐带血CD34+细胞来源的树突状细胞(dendritic cell, DC)的大量体外扩增、培养方法，并鉴定扩增后树突状细胞的生物学特征、活性及介导的杀伤细胞抗肿瘤效应。方法：收集健康足月产妇的新鲜脐带血，用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，利用CD34+磁珠进行阳性分选，然后将CD34+细胞接种到含有粒细胞巨噬细胞刺激因子（GM-CSF）和干细胞因子（SCF）的培养基中连续培养30天，并计数细胞量。在培养过程中，收集第14天的部分细胞，加入到含有GM-CSF、白介素-4（IL-4）细胞因子的培养基中，诱导分化为未成熟DC。利用倒置显微镜对所诱导的DC细胞每日进行形态学观察，并分别于第1、3、5天利用流式细胞术（FCM）检测DC细胞的表面分子CD80、CD83、CD86、HLA-DR表达率及利用FITC-右旋糖苷实验检测DC吞噬能力。然后取培养第5天的未成熟DC细胞负载LST-174、paca肿瘤全抗原（肿瘤细胞裂解物），同时加入TNF-а，2天后经流式细胞术检测负载肿瘤全抗原的DC细胞表面分子CD80、CD83、CD86、HLA-DR表达率。利用人淋巴细胞分离液分离外周血，得到外周血T淋巴细胞，经含有IL-2的培养基继续培养扩增。在含GM-CSF、IL-4的培养基培养过程中，分别将第5天的未成熟DC细胞（负载抗原前）和培养第7天的成熟DC细胞（负载抗原2天）与T淋巴细胞混合培养24小时，用CCK-8试剂盒检测DC混合T淋巴细胞反应。将培养第7天的DC细胞（负载抗原2天）与T淋巴细胞混合培养2天，制备抗原特异性CTL，将CTL加入到96孔板中的LST-174、paca肿瘤细胞混合孵育24小时，同时设立空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照组，利用CCK-8检测DC介导的细胞毒性T淋巴细胞对两种肿瘤细胞的杀伤效应。结果：1.可从50ml脐带血中平均分离约1.35*106个CD34+细胞，经30天连续培养，细胞数量由初始量平均扩增至1.47*1011个，平均扩增约109701倍；2.在30天的培养过程中，选择了第14天的细胞加入含GM-CSF、IL-4的培养基继续培养一周，细胞贴壁并具有典型的DC细胞形态。在培养第1、3、5天用流式细胞术分别检测CD34+来源的DC表面分子CD80表达率分别为3.70±0.65%、14.53±0.97%、44.27±4.78%；CD83表达率分别为11.47±1.22%、40.70±3.73%、53.50±2.21%；CD86表达率分别为49.97±4.83%、71.37±2.66%、74.80±3.89%；HLA-DR表达率分别为45.53±1.84%、71.33±4.32%、74.80±4.53%。第7天（负载抗原后2天）的DC，经流式细胞术检测DC表面分子CD80表达率为92.06±1.92%，表面分子CD83表达率92.07±2.09%，表面分子CD86表达率94.43±1.67%，表面分子HLA-DR表达率87.80±3.37%3．在培养第1、3、5天用流式细胞术检测CD34+来源的DC的吞噬能力，30分钟结果分别为61.83±4.10%、69.07±2.63%、75.87±2.49%；60分钟结果分别为60.73±2.68%、72.13±1.68%、78.97±2.41%。4.在培养第5天，检测CD34+来源的DC（负载抗原前）和第7天（负载抗原后2天）的DC的混合T淋巴细胞反应，设置的E:T=l:1、l:2、l:5、l:10、l:20、l:40的6个不同比例均有对淋巴细胞的促增殖作用，其中l:1、l:2组促增殖作用最强，而l:40组促增殖作用最弱。而负载抗原的成熟DC组的促增殖作用均高于未成熟DC组。5.在培养第五天，制备肿瘤抗原负载的DC疫苗，激活T细胞生成CTL，对肿瘤细胞LST-174、paca在不同效靶比下均有杀伤作用，其中在40:1效靶比下，杀瘤效率最高，LST-174组为64.33±1.14%，paca组为76.17±0.87%，随着效靶比浓度下降，杀瘤效率降低，在1:1效靶比下杀瘤效率最低，LST-174组为13.23±0.48%，paca组为20.03±1.16%。结论：1.经GM-CSF/SCF联合应用可诱导脐带血CD34+细胞生成大量前体DC细胞，并将前体DC细胞平均扩增可达105倍。2.扩增后的脐带血CD34+来源的DC前体细胞可诱导分化为典型的未成熟DC细胞,培养第5天后其吞噬能力最强，最适合负载抗原；DC混合T淋巴细胞反应显示促增殖作用显著，表面分子CD80，CD83，CD86，HLA-DR表达率较高，是最理想的负载抗原、制备DC疫苗的时机。3.负载LST-174、paca肿瘤全抗原的成熟DC诱导产生的CTL对两种肿瘤细胞具有特异性杀伤作用。提示扩增之后的DC细胞制备的DC疫苗激活机体抗肿瘤免疫是可行和有效的。

全文目录


摘要  4-7
ABSTRACT  7-10
英文缩写  10-11
前言  11-12
材料与方法  12-17
结果  17-20
附图  20-28
附表  28-31
讨论  31-33
结论  33-35
参考文献  35-37
综述 树突状细胞和脐带血来源的树突状细胞的研究进  37-43
  参考文献  41-43
致谢  43-44
个人简历  44

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 一般性问题 > 肿瘤治疗学
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