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ADAM17在U87胶质瘤干细胞迁移和侵袭中的作用及机制

作　者: 陈祥荣
导　师: 王向宇
学　校: 南方医科大学
专　业: 外科学
关键词: 神经胶质瘤肿瘤干细胞 ADAM17 信号通路迁移侵袭
分类号: R739.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

恶性胶质瘤(glioma)是中枢神经系统最为常见的原发性肿瘤,在所有颅内肿瘤中约占35.26%-60.96%,平均44.69%。尽管外科手术水平,放疗、化疗技术不断提高,但并没能显著改善脑胶质瘤患者的预后。胶质母细胞瘤(WHO Ⅳ级胶质瘤)患者平均生存期仅为14个月。肿瘤细胞高度侵袭性是胶质瘤高死亡率的主要原因,同时也是胶质瘤发生、发展进程中重要的生物学标志,与胶质瘤患者的预后密切相关。围绕着肿瘤侵袭机制的研究一直以来是胶质瘤研究的重点。肿瘤的侵袭转移是多基因、多步骤相互作用的过程,主要包括恶性肿瘤细胞从原发灶迁移粘附到细胞外基质(extracellular matrix, ECM))、降解并穿过ECM和基膜、通过血管进入宿主微环境等步骤。目前观点认为,细胞外基质降解酶系统如基质金属蛋白酶家族(Matrixmetalloproteinases, MMps)和去整合素-金属蛋白酶家族(a disintegrin and metalloprotease s, ADAMs)等参与了肿瘤侵袭过程。ADAM17又称为肿瘤坏死因子a前体转换酶(Tumor necrosis factor-alpha Converting Enzyme, TACE),是去整合素-金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase, ADAMs)家族重要成员之一。由于具有水解细胞膜上的肿瘤坏死因子,同时能酶解活化多种表皮生长因子受体(EGFR)的配体,激活EGFR相关信号通道,与肿瘤的侵袭密切相关。ADAM17在肿瘤侵袭机制中的作用研究日益成为研究的热点。近来发现ADAM17在多种肿瘤组织中高表达,包括非小细胞肺癌,乳腺癌,卵巢癌,肾癌,前列腺和胰腺癌等。研究表明ADAM17同样在人胶质瘤细胞中高表达,与胶质瘤的恶性进展密切相关。Zheng等构建针对ADAM17的ShRNA表达载体转染处理人胶质瘤U87细胞,揭示ADAM17shRNA干扰后U87细胞增殖,粘附和侵袭能力降低,凋亡增加。绝大部分胶质瘤属于实体性肿瘤。实体性肿瘤细胞的侵袭是一个涉及基底膜与细胞外基质降解；肿瘤细胞增殖、粘附、迁移；肿瘤血管内皮细胞增殖、血管生成：肿瘤细胞通过血管转移的复杂过程。结合ADAM17自身的结构特点,酶裂解的生物学功能及其活化胞内多条信号通路的特性,推断ADAM17在胶质瘤细胞侵袭转移中发挥了重要的生物学作用：其一,ADAM17能降解细胞外基质中的Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原、明胶和弹性纤维(构成基底膜的主要成分),使细胞间质的空隙增大,为肿瘤血管的形成提供有利的空间,参与胶质瘤的侵袭和转移；其二,ADAM17还可以增强促血管生成因子的作用,与多种血管生成相关因子的表达或分泌密切相关,包括血管内皮生长因子及受体(VEGF/VEGFR)、缺氧诱导因子(HIF)、成纤维生长因子(bFGF)、趋化因子(cbemokines)、表皮生长因子及受体(EGF/EGFR)、白细胞介素(IL)等,直接或间接参与肿瘤血管生成、促进肿瘤迁移和侵袭。其三,ADAM17可以剪切脱落和活化肿瘤坏死因子a(TNF-α)、转化生长因子(TGF-α),白介素6(IL-6)、双调蛋白(AR)等多种表皮生长因子受体(EGFR)的配体,激活EGFR相关通道。由酪氨酸蛋白激酶活化引起的级联反应,激活P13K/AKT、 MEK/ERK等多条信号通路,最终影响肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。ADAM17通过激活EGFR及其下游相关信号通路在介导肿瘤侵袭中发挥至关重要作用.因此研究ADAM17和所调控EGFR相关信号通路((PI3K/AKT和MEK/ERK通路)在胶质瘤中的表达情况和对胶质瘤迁移和侵袭的调控机制,尤其是始动环节的介导作用,对于进一步了解ADAM17的功能、作用机制及胶质瘤侵袭性机制有着重要的意义。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)理论的提出深化了人们对于恶性胶质瘤起源的认识,也为研究肿瘤侵袭性的调控机制,尤其是始动环节的介导作用等问题提供了新思路。越来越多的证据表明,在肿瘤内部存在着一组具有干细胞特性的小的细胞集群一肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)或称肿瘤始动细胞(tumor initiating cells)。胶质瘤CSCs即胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)表达细胞表面抗原CD133和神经巢蛋白(nestin),并具有自我更新、多向分化以及体内成瘤的能力,可以分化成多种子代细胞成分,参与肿瘤的发生、发展,并且与肿瘤的化疗耐药性及放疗抗性密切相关,因此在胶质瘤的发生、发展进程中发挥了决定性作用,被认为可能是胶质瘤发生、侵袭转移、治疗抵抗以及复发的根源。然而,这群GSCs在胶质瘤侵袭中所扮演的角色尚不清楚：它们是否始动或参与了胶质瘤侵袭过程?其分子机制如何?新近我们发现,GSCs高表达ADAM17,具体生物学功能意义不清。考虑到ADAM17在EGFR相关信号通路激活起“起始开关”,与肿瘤迁移和侵袭密切相关。我们推测,GSCs高表达的ADAM17能够通过活化EGFR及下游相关信号通路(PI3K/AKT和MEK/ERK),促进胶质瘤迁移和侵袭。本研究中,我们首先观测在不同病理级别胶质瘤组织中ADAM17表达情况及临床意义,明确ADAM17表达与胶质瘤病理级别成正相关,有望成为抗胶质瘤治疗新的靶点；然后,我们检测了GSCs标志物CD133在胶质瘤细胞系U87的表达,并从中成功分离、培养和鉴定出GSCs;研究了ADAM17在GSCs中的表达及ADAM17基因敲除或化学增强剂活化后对胶质瘤干细胞迁移和侵袭的影响；最后,我们探讨了EGFR相关信号通路(PI3K/AKT和MEK/ERK)在ADAM17调控GSCs介导的肿瘤迁移和侵袭中的作用机制,证实ADAM17可能通过调控EGFR及其下游PI3K/AKT信号通路影响GSCs迁移和侵袭。第一部分ADAM17在不同恶性程度胶质瘤组织中的表达及临床意义目的探讨ADAM17在不同恶性程度胶质瘤组织中的表达情况及其与患者预后的关系。方法收集103例手术切除的胶质瘤组织及14例癫痫颞叶切除的相对正常脑组织,应用荧光定量PCR、免疫组化染色等方法检测组织标本中ADAM17基因、蛋白的表达情况,并与胶质瘤的恶性程度进行Spearman相关分析；利用预后生存分析探讨胶质瘤组织中ADAM17的表达水平与患者预后的关系。结果胶质瘤组织的ADAM17表达高于正常脑组织(P<0.01),与胶质瘤的病理级别呈正相关(r=0.76)；预后生存分析显示高级别胶质瘤患者ADAM17高表达预示着较短的生存时间；Cox回归多因素分析显示ADAM17是胶质瘤患者独立的预后危险因素。结论检测胶质瘤组织中ADAM17的表达水平有助于评价胶质瘤的生物学行为和患者的预后,具有临床研究价值。第二部分人恶性胶质瘤细胞系U87中分选、培养和鉴定胶质瘤干细胞目的从人恶性胶质瘤细胞系U87中分选、培养和鉴定胶质瘤干细胞,为研究胶质瘤干细胞侵袭性奠定基础。方法选择人恶性胶质瘤细胞系U87,利用流式细胞仪分选出CD133+的细胞。通过无血清培养基(DMEM/F12+20ng/mL bFGF+20ng/mL EGF+100μl B27)培养获得呈悬浮生长的U87肿瘤干细胞球；利用免疫荧光、western-blot对U87肿瘤干细胞球形态、自我更新能力、免疫表型、多向分化能力进行鉴定。结果CD133+U87胶质瘤细胞能够在无血清培养基中呈克隆球样悬浮生长,并且能够传代增殖。经免疫荧光染色及流式细胞仪检测,肿瘤球细胞高表达干细胞标志CD133和Nestin。将肿瘤球在含血清培养基中进行诱导分化,表现多向分化潜能,产生表达星形胶质细胞(GFAP)、神经元(β-tubulin Ⅲ)和少突胶质细胞(GA1C)的子代肿瘤细胞。结论人恶性胶质瘤细胞系U87中存在着一组具有干细胞特性的小的细胞集群(GSCs),利用流式细胞仪分选和无血清培养剂能有效的分离和扩增U87细胞系中的胶质瘤干细胞。第三部分ADAM17通过调控EGFR信号通路影响胶质瘤干细胞迁移和侵袭目的研究ADAM17对胶质瘤干细胞(GSCs)迁移和侵袭的影响,并探索EGFR相关信号通路(PI3K/AKT和MEK/ERK)在ADAM17调控GSCs介导的肿瘤迁移和侵袭中的作用机制。方法分别采用免疫荧光及Western-blot检测GSCs中ADAM17蛋白的表达;利用RNA干扰(ShRNA)技术阻滞或ADAM17特异性增强剂(PMA)强化ADAM17mRNA及蛋白表达, Transwell小室实验检测各干预组GSCs迁移和侵袭性的变化：同时利用Western blot检测检测ADAM17、EGFR/p-EGFR、AKT/p-AKT、 ERK/p-ERK的蛋白表达变化。用SPSS13.0对数据进行统计分析,组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05认为差异有统计学意义。结果相对于CD133-细胞,GSCs高表达ADAM17, ADAM17ShRNA能有效抑制GSCs的迁移和侵袭,反之ADAM17特异性增强剂(PMA)能增强GSCs的迁移和侵袭(P<0.05或P<0.01)。ADAM17通过调控EGFR及其下游PI3K/AKT和MEK/ERK信号通路影响GSCs迁移和侵袭,其中EGFR/PI3K/AKT信号通路在其中发挥至关重要作用(P<0.05)。结论ADAM17调控胶质瘤干细胞迁移和侵袭,可能与EGFR/PI3K/AKT信号通路相关,有望成为治疗恶性胶质瘤的新靶点。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-17
前言  17-21
  参考文献  19-21
第一部分 ADAM17在不同恶性程度胶质瘤组织中的表达及临床意义  21-37
  一、引言  21
  二、实验材料和方法  21-28
  三、结果  28-32
  四、讨论  32-34
  小结  34-35
  参考文献  35-37
第二部分人恶性胶质瘤细胞系U87中分选、培养和鉴定胶质瘤干细胞  37-52
  一、引言  37-38
  二、试验材料和方法  38-45
  三、结果  45-48
  四、讨论  48-49
  小结  49-50
  参考文献  50-52
第三部分 ADAM17通过调控EGFR相关信号通路影响胶质瘤干细胞迁移和侵袭  52-73
  一、引言  52-53
  二、实验材料和方法  53-61
  三、结果  61-67
  四、讨论  67-69
  小结  69
  参考文献  69-73
全文总结  73-75
文献综述  75-83
  参考文献  79-83
中英文缩略词对照表  83-84
学习期间发表论文  84-85
致谢  85-86

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