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NIX基因在胶质瘤中调控NF-κB的临床及实验研究

作　者: 李宏
导　师: 漆松涛
学　校: 南方医科大学
专　业: 外科学
关键词: 胶质瘤星形细胞瘤间变性星形细胞瘤胶质母细胞瘤胶质瘤 NF-κB NlX/BNIP3L U251
分类号: R739.41
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景与目的胶质瘤作为颅内最常见的恶性肿瘤,约占全部原发中枢神经系统肿瘤的70%,依据WHO2007年的分类：Ⅰ/Ⅱ级肿瘤称为低级别的胶质瘤,包括毛细胞型星形细胞瘤、多形性黄色星形细胞瘤、神经节胶质瘤、少突胶质瘤及混合性少突星形细胞瘤等；高级别胶质瘤亦称恶性胶质瘤,即Ⅲ/Ⅳ级肿瘤,包括星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、间变性星形细胞瘤等。尽管近年来显微外科手术、放疗、化疗以及生物治疗等多模式治疗的应用,但大多数肿瘤患者的预后仍然十分悲观,术后同步放化疗的治疗方案也仅仅是增加了新诊断GBM患者有限的中位生存期。但是从目前的临床随访结果来看,仍有部分恶性胶质瘤有较长的生存期,目前对于胶质瘤的发生、发展、预后以及放化疗耐药的分子机理仍然存在着诸多的疑问,在不同病理级别的胶质瘤或者相同病理级别不同预后的胶质瘤之间寻找差异基因,对于阐明决定预后的分子机制不失为一种有效的策略。BNIP3是bcl-2家族中BH3-only亚家族的成员,BNIP3a (又称nip-like protein X,Nix)作为BNIP3成员之一,同BNIP3一样具有BH3结构域和跨膜区,与Bcl-2、Bcl-X1等蛋白相互作用,通过线粒体途径促进细胞的凋亡.Nix在肿瘤的进展中扮演着重要的角色,缺氧和甲基化可以诱导Nix的表达异常,促进Nix的表达可以诱导肿瘤细胞凋亡。核转录因子kappa B(NF-κB)是一类重要的转录激活因子,通过和某些基因上启动子区的固定核苷酸序列结合而启动基因转录的功能,广泛存在于各种真核细胞中。NF-κB与肿瘤的发生、发展密切相关,它通过不同的作用机制广泛参与多种致瘤基因、细胞因子的转录调节。NF-κB既可促进肿瘤的发生发展,也能在特定的病理生理状态下抑制肿瘤的发生发展,因此深入探讨NF-κB在肿瘤中的作用有重要的意义。本研究通过检测Nix和P-NF-κB在胶质瘤中的表达,并采用siRNA干扰Nix在胶质瘤细胞中的表达,检测细胞内NF-κB通路上蛋白的变化以及干扰后对在不同培养条件下细胞凋亡的影响,寻找Nix与NF-κB通路相互关系的证据,为发现脑胶质瘤治疗新靶点提供依据。研究内容与方法1.Nix蛋白和Ip-NF-KB在胶质瘤中的表达以及Nix蛋白表达与预后的关系。实验材料：按照纳入标准收集南方医科大学南方医院神经外科2007年1月至2009年1月经常规HE切片后确诊为脑胶质瘤的标本46例,以上病例均有较完整的临床资料和术后长期随访结果。患者纳入标准：1.南方医院神经外科2007—-2009经手术确诊为星形细胞瘤(AS,WHO Ⅱ级)、间变性星形细胞瘤(AA, WHO Ⅲ级)、胶质母细胞瘤(GBM,WHOⅣ级)病例；2.首次就诊且术前未行化疗或者放疗；3.恶性胶质瘤(AA和GBM)术后行替莫唑胺同步放化疗治疗；4.随访5年以上；5.病历资料完整。实验方法：利用RT-PCR检测Nix在胶质瘤组织中mRNA的表达量；利用Western blot方法检测Nix、IκBα以及总P-NF-κB蛋白表达水平,采用免疫组织化学技术检测46例Ki-67胶质瘤中的表达情况,用Olympus OlysiaBioreport图像分析系统测试10个视野Ki-67区域阳性的百分率,分析在不同病理类型的肿瘤组织中Ki-67与Nix蛋白表达之间的关系。采用原位TUNEL法检测42例肿瘤组织细胞的凋亡情况(另4例应为标本体积和质量不好未能检测),用Olympus OlysiaBioreport图像分析系统测试10个视野凋亡细胞出现的百分率,分析在不同病理类型的肿瘤组织中凋亡率与Nix蛋白表达之间的相互关系。采用Kaplan-Meier法进行生存分析。2.Nix基因在胶质瘤中的功能及初步分子机制研究通过设计合成Nix基因siRNA干扰片段瞬时转染胶质瘤细胞U251,同时以si-Scrambled片段作为空白对照(Nix-wt)。利用Western blot检测干扰效率,选取干扰效率最高的siRNA片段。实验设空白对照组(Nix-wt)、实验组(Nix-kn)。(1)转染48小时后每组又分别用正常培养和缺氧培养处理,12小时后采用Western blot检测每组细胞内总p-NF-κB/p65、p-IκBα、p-IKKα、IκBα蛋白的表达和核内p-NF-KB/p65蛋白的表达；用EMSA和luciferase报告基因检测每组细胞核内NF-κB的活性；(2)转染48小时后每组又分别用正常培养和LB培养处理,12小时后用流式细胞术和DAPI荧光染色检测Nix基因在细胞水平对正常培养和LB培养下细胞凋亡的影响；以上统计学分析应用SPSS15.0统计分析软件进行处理。采用2独立样本检验分析对数据进行统计分析。以P<0.05表示差异具有显著性。应用2独立样本非参数的方法分析在不同病理类型的肿瘤中患者的KPS评分与Nix蛋白表达之间的关系。采用Kaplan-Meier法进行生存分析,显著性检验采用Logrank法。结果一.Nix蛋白和P-NF-κB在胶质瘤中的表达以及Nix蛋白表达与预后的关系1.Nix蛋白和P-NF-κB在胶质瘤组织中的表达利用western blot进行46例胶质瘤组织中Nix及P-NF-κB蛋白的表达检测,结果显示17例肿瘤组织高表达Nix蛋白,其中有6例AS、5例AA、6例GBM,且在不同病理类型的肿瘤组织内,Nix和P-NF-κB蛋白的高表达与IκBα蛋白的低表达有较好的一致性；利用qRT-PCR技术检测46例胶质瘤组织中Nix mRNA的表达水平,结果显示病理类型为GBM的肿瘤组织与AS和AA相比,胶质瘤中的Nix表达显著上调(P值分别为0.003和0.027),但是AS与AA相比,Nix在胶质瘤中表达未见明显差别,将每种病理类型分为Nix(+)和Nix(-)两组,结果显示在AS组内,Nix基因的1nRNA水平有明显差异(P=0.04),在高级别的肿瘤组织中(AA和GBM)未见这种差异。2.Nix蛋白表达与预后的关系为了证实Nix蛋白与肿瘤的生物学行为及预后之间的关系,分析患者的Ki-67与Nix蛋白表达的相互关系,结果发现在18例AS中,Nix(-)患者的Ki-67蛋白表达较Nix(+)显著增高(P=0.037),暗示Nix阴性表达的肿瘤有更高的侵袭力,在13例AA和16例GBM组内,Ki-67蛋白表达在Nix(-)患者和Nix(+)患者之间未见明显差异.；分析46例患者的KPS评分与Nix蛋白表达的关系,结果发现在AS和AA组内,Nix(+)患者的KPS评分较Nix(-)增高(P值为0.045和0.047),在GBM组内未见这种差异性；分析42例肿瘤组织细胞的原位TUNEL法凋亡检测结果显示,在GBM组内,Nix(-)患者的凋亡率较Nix(+)显著增高(P=0.015),在AS和AA组内未见这种差异。生存分析的结果显示,所有胶质瘤病人中,Nix(+)组患者肿瘤无进展生存期明显长于Nix(-)组(P=0.038),亚组分析显示,在AS组中,这种差别更大,而在高级别的胶质瘤(AA和GBM)中,这种差别不显著。二.Nix基因在胶质瘤细胞的功能初步研究用western blot进行Nix蛋白的表达检测,4种干扰片段较空白对照均具有较强的干扰效率,在Nix siRNA转染胶质瘤U251细胞48h后,与空白对照组相比,Nix的表达显著降低。在胶质细胞瘤U251的空白对照组(Nix-vvt)、实验组(Nix-kn)组内又分别进行正常培养和缺氧培养两种不同处理,空白对照组缺氧培养较正常培养下的p-NF-κB/p65、p-IκBα、p-IKKα、细胞核内p-NF-κB/p65蛋白表达升高、IκBα蛋白表达下降,在实验组(Nix-kn)缺氧培养和正常培养下的p-NF-κB/p65、 P-IκBα、p-IKKα、细胞核内p-NF-κB/p65蛋白表达未见差异；采用EMSA的方法检测正常培养和缺氧培养两种不同处理下的空白对照组(Nix-wt)、实验组(Nix-kn)胶质瘤U251细胞核内的NF-κB活性,结果显示在缺氧条件下,实验组(Nix-kn)激活的NF-κB高表达,其他组间未见有表达。Luciferase报告基因检测每组细胞核内NF-κB的活性结果显示,DMEM培养组内,Nix表达下调后,U251细胞细胞核内NF-κB的表达和阴性对照组比较差异无显著意义(P=0.086)在LB培养组内,Nix表达下调后,U251细胞细胞核内NF-κB的表达较阴性对照组明显增多(P=0.011)。采用流式细胞术分析胶质瘤细胞U251的细胞凋亡分布改变,结果发现,在DMEM培养组内,Nix表达下调后,U251细胞凋亡和空白对照组比较差异无显著意义(Nix-wt3.09±1.65%,Nix-kn4.04±0.89%,P=0.43)在LB培养组内,Nix表达下调后,U251细胞凋亡较阴性对照组明显增多(Nix-wt7.15±0.87%, Nix-kn11.24±2.15%,P=0.037)；DAPI荧光染色检测胶质瘤细胞U251的细胞凋亡结果显示,在DMEM培养组内,Nix表达下调后,U251细胞凋亡和阴性对照组比较差异无显著意义(Nix-wt3.43±1.47%,Nix-kn3.52±2.4%, P=0.95)在LB培养组内,Nix表达下调后,U251细胞凋亡较阴性对照组明显增多(Nix-wt7.37±1.17%, Nix-kn13.33±3.28%,P=0.041).结论Nix蛋白在胶质瘤的形成过程中可能扮演了双重角色,在NF-κB低表达的低级别的胶质瘤(Ⅱ级)中,Nix蛋白通过BAX促进肿瘤细胞凋亡,是肿瘤抑制因子,而在高级别的胶质瘤中(Ⅲ级和Ⅳ级)中,Nix蛋白和NF-κB共同扮演了癌基因的角色。另外在AA和GBM中,Nix蛋白和基因的不一致性,这提示Nix基因的转录后调节参与了其蛋白的表达,其具体机制需要进一步进行研究。

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摘要  3-8
ABSTRACT  8-15
第一章 NIX和p-NF-κB在脑胶质瘤组织的表达及其临床意义  15-34
  一材料与方法  16-28
  二结果  28-34
第二章 Nix基因在胶质瘤细胞的功能初步研究  34-50
  一材料与方法  35-44
  二结果  44-50
全文讨论  50-56
参考文献  56-62
英文缩写词简表  62-64
学习期间发表论文情况  64-65
致谢  65-67

NIX基因在胶质瘤中调控NF-κB的临床及实验研究

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