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孤独症易感基因NRXN1突变体蛋白的生物学功能研究

作　者: 罗三川
导　师: 夏昆
学　校: 中南大学
专　业: 遗传学
关键词: 孤独症 NRXN1 突变体功能研究
分类号: R749.94
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

背景：孤独症谱系障碍(Autism Spectrum Disorder, ASD)简称孤独症,又称自闭症,是一种严重的儿童精神发育障碍疾病,主要表现为语言沟通和社会交往障碍,并伴有狭隘兴趣和重复刻板行为,通常3岁前发病。孤独症的病因学和发病机制尚未被阐明,而其诊断只能依靠行为学的观察。研究显示,一些影响神经发育的基因,比如与突触发生和突触可塑性相关的一些基因是孤独症易感基因。Neurexins(以下简称NRXNs)是一类特异表达于哺乳动物大脑的细胞粘附分子,而NRXN1是近年来研究得最广泛的孤独症易感基因之一。NRXN1表达在突触前膜,与突触后膜的一些粘附分子相互作用,在突触的形成、成熟以及神经传递中起重要作用。在前期研究中我们在孤独症患者中鉴定了三个NRXN1错义突变Y315H、L933V和I1175V,本研究针对这三个错义突变构建表达载体,分析了NRXN1突变型蛋白在亚细胞定位、降解途径、蛋白稳定性等生物学功能上的改变,探讨了这三个位于α-NRXNl的变异的可能的致病机理。方法：为研究在孤独症患者中发现的NRXN1的三个错义突变Y315H、L933V、I1175V对NRXN1蛋白功能的影响,进而探讨其在孤独症发病中的影响,我们构建了NRXN1野生型和突变型的表达载体,筛选了表达NRXN1野生型和突变型蛋白的HEK293稳定细胞系,对这些蛋白的分布、稳定性和降解途径进行了分析,从而初步阐明这几个错义突变对NRXN1生理功能的影响以及对突触的影响。通过与内质网标志蛋白的免疫荧光染色,对NRXN1野生型及突变型蛋白的亚细胞定位进行了研究；用蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂CQ阻断蛋白质降解的可能的途径,确定了NRXN1野生型和突变型蛋白在细胞内的降解途径；用CHX抑制细胞的蛋白质合成,确定了蛋白质的降解速率。结果：对三个错义突变进行生物学功能分析发现,三个突变体蛋白在HEK293细胞中呈胞浆分布和膜分布,与NRXN1野生型蛋白无明显差别；蛋白质的降解主要通过自噬溶酶体途径,与野生型没有差别；突变体NRXN1-Y315H的降解速率相对于野生型蛋白有所减慢,NRXN1-L933V降解速率有所加快,而NRXN1-I1175V降解速率与野生型蛋白无明显差别。结论：上述结果表明,在孤独症患者中发现的三个错义突变的相关突变蛋白的表达、修饰、转运、亚细胞定位在非神经源性的细胞HEK293中与野生型没有差别,但是突变Y315H和L933V可能影响了NRXN1蛋白的降解过程。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
英文词缩略表  8-10
前言  10-14
1 主要仪器、试剂与耗材  14-18
  1.1 主要实验仪器  14-15
  1.2 主要实验试剂及耗材  15-18
2. 实验方法  18-31
  2.1 保守性分析  18
  2.2 质粒的构建  18-23
    2.2.1 试剂的配制  18-19
    2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化  19-20
    2.2.3 构建质粒  20-23
  2.3 NRXN1-HEK293稳定表达细胞系的筛选  23-30
    2.3.1 细胞培养  23-24
    2.3.2 转染  24-25
    2.3.3 鉴定方法  25-30
  2.4 NRXN1蛋白的亚细胞定位  30
  2.5 NRXN1野生型蛋白和突变型蛋白生化特性的测定  30-31
    2.5.1 蛋白质半衰期的确定  30
    2.5.2 降解途径的确定  30-31
3. 实验结果  31-38
  3.1 保守性分析结果  31
  3.2 载体构建质粒测序结果  31-32
  3.3 NRXN1稳定表达细胞系鉴定结果  32-33
  3.4 NRXN1野生型及突变型蛋白的亚细胞定位  33-36
  3.5 蛋白质半衰期  36-37
  3.6 蛋白质降解途径  37-38
4. 分析与讨论  38-39
5. 结论  39-40
参考文献  40-42
综述  42-55
  参考文献  49-55
攻读学位期间主要的研究成果  55-56
致谢  56-57
个人简历  57

孤独症易感基因NRXN1突变体蛋白的生物学功能研究

内容摘要

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