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高糖环境下GDNF及其受体在müller细胞的表达及作用

作　者: 朱新平
导　师: 彭裕文
学　校: 复旦大学
专　业: 人体解剖与组织胚胎学
关键词: 胶质细胞源性神经营养因子 Muller细胞糖尿病视网膜眼病细胞培养
分类号: R587.2
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

糖尿病可以引起各种眼部疾病：视网膜病变、白内障、波动性屈光不正、开角型青光眼、缺血性视突病变、眼球运动神经麻痹等。其中,糖尿病导致的视网膜病变(diabetic retinopathy,简称DR),是糖尿病最为常见的慢性并发症之一,它能使患者视力减退,是目前双目失明最重要的原因。以前研究多以视网膜内皮细胞及其周围的周细胞组成的视网膜微血管损害为目标。随着研究的深入,发现除了视网膜微血管损害以外,DR还是一种神经组织的慢性退行性变。这包括视网膜厚度降低,神经细胞凋亡增加,在病变早期就有神经元凋亡和Muller细胞增生等表现。Muller细胞在DR的病理过程中的作用日益受到重视,目前研究表明其具有调整视网膜内谷氨酸和糖代谢的功能,进而影响神经元存活。因此,研究Muller细胞本身的抗损伤及活化增殖机制,对于了解DR发病的病理过程及DR的预防和治疗具有重要的研究价值。胶质细胞源性神经营养因子(glial cell-line-derived neurotrophic factor, GDNF)是转化生长因子-B (TGF-B)家族中的成员,其配体结合受体为GDNF家族受体α1(GDNF family receptor α1, GFR α1)及α2。以前研究多集中在其对于神经元的保护作用及胚胎期神经元分化作用,近年来对于GDNF及其受体在视网膜的研究表明,在视神经切断模型中GDNF可以有效减轻视网膜内神经节细胞和感光细胞凋亡。在DR动物模型中,眼球内注射GDNF后能够促进Muller细胞产生多种神经营养因子,起到增强细胞的迁移能力,维护视血管-网膜屏障稳定,提高Muller细胞摄取谷氨酸的能力,,并对视网膜神经元及感光细胞起到保护作用。虽然有研究表明Muller细胞可以产生GDNF,其GDNF受体各亚型在视网膜Mulle细胞上也有表达。但很多研究也认为在视网膜中Muller细胞不分泌GDNF,其仅有GFR的表达。这主要因为各文献中所采用的实验动物种属、病变模型及时间都不统一,因此目前尚无定论。在DR病理基础方面,目前聚焦于Mulle细胞的研究比较少。对于其是否会表达GDNF及其受体是否有变化,及对于其自身的影响情况,目前尚未见报道。从其它视网膜病变的研究中我们可以看出,GDNF和Muller细胞在视网膜病变中各自起着非常重要的保护作用,但两者在DR病变中的关系以及作用机理目前尚不清楚。因此本课题在纯化Muller细胞培养的情况下,给予模拟DR的高糖环境后,对于以下三方面进行研究：1.应用免疫荧光双标及TUNEL染色技术在纯化Muller细胞培养的基础上检测了正常情况下GDNF及其受体GFR α1及α2的表达情况,并在模拟的高糖培养环境下外源性给与GDNF后检测了Muller细胞的凋亡情况,并与正常组及高糖组结果进行了统计学分析。结果显示：正常情况下Muller细胞表达少量GDNF及其受体GFR α1及α2；高糖培养环境可以有效地模拟DR损伤,对Muller细胞具有损伤作用；外源给予GDNF后可以保护高糖环境下的Muller细胞,但与正常组仍有差距。本结果提示：虽然正常条件下Muller细胞可以产生少量GDNF,但不足以对抗高糖环境对于细胞的损伤,外源给予GDNF可以有效减轻高糖引起的Muller细胞损伤情况。2.应用免疫荧光双标,、(?)estern-Blot及Real-Time PCR等技术检测了在高糖组及高糖加GDNF组内Muller细胞不同时段内GDNF、GFR α1及α2的表达变化。结果显示：高糖环境下Muller细胞内GDNF可以随时间延长合成逐渐增加；其受体GFR-α1同时升高；GFR α2则在早期升高后,随病理时间延长合成逐渐下降。而在高糖加入GDNF后,GFR α1/α2及胞内GDNF表达强度及蛋白合成较单纯高糖组在24h和48h时段均有非常显著的升高,1W后两组间的各项指标差别变小。本结果提示：高糖环境可以促使Muller细胞合成GDNF及其受体,而外源给予GDNF可以显著加速和提高合成；Muller细胞内GDNF和GFR α1的合成升高可能与胞外GDNF的浓度及病理时间相关,外源给予高浓度GDNF可以加快Muller细胞的GDNF和GFR α1的合成速度；早期Muller细胞接受GDNF信号可能是通过GFR α2受体,其早期快速合成升高可能是Muller细胞对抗高糖损伤及促进细胞合成GDNF及GFR-α1的关键。3.应用免疫荧光双标,Western-Blot及Real-Time PCR等技术检测在高糖加GDNF组给予两种选择性通道阻断剂后,不同时段内GDNF、GFR α1及α2的表达变化,研究GDNF的胞内信号通路。结果显示：给予GDNF胞内信号阻断剂后,Muller细胞胞内两条信号通路均可以影响胞内GDNF和GFR α1和2的合成,Ras/Raf/MEK/Erk信号通路影响GDNF和GFR α1和2合成的作用更加明显。本结果提示：在高糖条件下Muller细胞本身合成GFR α1和GDNF的能力可能主要受胞外GDNF浓度的影响；GDNF在Muller细胞胞内的信号传递通路选择可能是以MEK/ERK通路为主；GFR α2的合成受高糖环境刺激影响,并主要通过MEK信号通路来加速GDNF的合成；GDNF对高糖环境下Muller细胞的作用除了对抗细胞自身损伤外,可能还有促进细胞增殖及迁移的功能。通过本课题的研究,我们证明了GDNF对于高糖环境下Muller细胞的保护作用。发现高糖环境下Muller细胞合成GDNF及GFR α1的能力随病理时间延续而增强,而GFR α2的合成随着GDNF浓度的升高和病理时间延续逐渐降低。通过对GDNF在Muller细胞胞内信号通路的研究,发现MEK/ERK通路在高糖环境下是高糖刺激下Muller细胞胞内GDNF和GFR合成的的主要信号通路选择。GDNF可能具有促进Muller细胞增殖的功能。外源给予GDNF可以有效加速上述过程,并减轻Muller细胞的损伤。本课题为Muller细胞在DR中的作用和机制研究提供了实验室数据和资料。

全文目录

缩略词表  4-6
摘要  6-9
ABSTRACT  9-13
引言  13-16
第一部分：正常环境下GDNF及其受体在MULLER细胞的表达及高糖环境下GDNF的作用  16-27
  前言  16-17
  材料和方法  17-21
  结果  21-25
  讨论  25-27
第二部分：高糖和外源给予GDNF后MULLER细胞GDNF及其受体的变化  27-48
  前言  27
  材料和方法  27-35
  结果  35-45
  讨论  45-48
第三部分：高糖环境中影响MULLER细胞GNDF及受体合成的胞内通路研究  48-63
  前言  48-49
  材料和方法  49-51
  结果  51-60
  讨论  60-63
全文总结  63-64
本课题创新点  64-65
参考文献  65-70
综述  70-79
  参考文献  76-79
附件  79-80
致谢  80-81

高糖环境下GDNF及其受体在müller细胞的表达及作用

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