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EGCG干预非酒精性脂肪肝大鼠代谢组学研究

作　者: 蒋华军
导　师: 刘仲华
学　校: 湖南农业大学
专　业: 药用植物资源工程
关键词: 非酒精性脂肪肝病 EGCG 代谢组学超高压液相色谱-串联四级杆-飞行时间质谱代谢通路模式识别技术
分类号: R575.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

近年来,由于人们生活水平的提高,高脂肪、高胆固醇饮食增加,使得非酒精性脂肪肝(NAFLD)患病率迅猛增高,现已成为危害人类健康的三大肝病之一。NAFLD病理过程复杂,涉及体内多角度、多层次的生理生化过程,其致病机制尚未明确。到目前为止,非酒精性脂肪肝尚无治疗的理想药物,临床上主要使用调血脂药对其进行治疗。但是这些药物会加重脂质在肝脏的沉积,容易引起和加重肝损伤,所以其安全性尚需进一步评价。因此近年来从植物资源中寻找高效、安全的天然产物来改善和治疗非酒精性脂肪肝和代谢综合征已成为研究的一大热点。EGCG是从绿茶叶中分离出来的一种具有多元酚羟基的儿茶素单体,是儿茶素中含量最高的单体化合物,大约占儿茶素总量的80%。因此也是绿茶的保健及药理功能的主要活性成分。已有研究表明EGCG具有抗氧化、降血糖、保护心脑血管、抗肝纤维化、抗肿瘤等生物活性。另外有大量研究表明,多酚类化合物具有保肝护肝,降脂减肥的功效。但是对于其作用机理报道很少,已有的研究也是基于几个生化指标小分子、基因或蛋白展开研究,这样就很难全貌地了解儿茶素及EGCG的作用途径,也很难解释清楚这个复杂的致病及防治机理。代谢组学具有整体性研究特点,能通过系统地检测复杂的、动态的变化来辨识和解析被研究对象的生理病理状态,对于阐明生命复杂现象系统具有极为重要的意义。因此,本研究以高脂饲料诱导SD大鼠肝脏病变,建立非酒精性脂肪肝模型,然后通过EGCG干预模型大鼠,并利用代谢组学技术研究EGCG对高脂诱导的脂肪肝病的疗效,从系统生物学角度全面考察EGCG对大鼠NAFLDD旨类代谢的影响,为茶叶资源的高值化利用、促进茶叶消费以及非酒精性脂肪肝和代谢综合征的高效、安全的治疗型药物的开发提供科学依据。主要研究结果如下：1、EGCG干预NAFLD大鼠的药效学研究。通过高脂饲料诱导SD大鼠肝脏病变,建立NAFLD模型,再用EGCG溶液对模型大鼠灌胃5周。第9周末处死大鼠后,测定其血液和肝脏的生化指标,并制作肝脏病理切片。结果显示,与HCG组相比,MCG组血液中TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT、AST、GLU、MDA均升高,SOD降低。经EGCG干预后,与MCG组相比,EIG组血液中除LDL-C仍略有上升外,其它指标均向HCG组方向变化。与HCG组相比,MCG组体重、肝湿重、肝系数、肝脾比都上升,肝匀浆液中TC、TG、MDA均升高,SOD降低。经EGCG干预后,与MCG组相比,EIG组肝匀浆液中各项指标均逆向回落。肝切片光学显微镜检查结果显示,EIG组大鼠肝细胞脂肪变性的程度和脂肪颗粒沉积数目明显减少。2、EGCG干预NAFLD大鼠尿液代谢组学研究。通过UPLC-Q-TOF建立了尿液代谢组学分析方法,然后利用这个分析方法评价尿液的不同前处理方法,筛选出最佳前处理方法为：400μ L尿液+400μL冷乙腈+400μ L冷甲醇,涡旋混匀,冰浴5min,然后4℃下以14000rpm离心5min,取上清液。将各组样品前处理后连续采集全部数据。然后对原始数据进行分子特征提取,二维数据矩阵批量导出,滤噪、峰对齐、峰匹配、标准化和归一化等数据预处理,再将数据分组、频率过滤、显著性分析、倍率过滤,然后通过MPP内置的ID Browser功能对潜在的生物标记物检索数据库,最后返回MassHunter中验证潜在差异化合物的真实性。验证后真实的差异标志物如下：琥珀酸、α-酮戊二酸、马尿酸、葡萄糖酸、辛酸、黄嘌呤、色氨酸、黄素单核苷酸、AMP、甜菜碱、辅酶R。最后根据差异标志物探索可能的代谢通路并筛选确定可能的生物标记物。3、EGCG干预NAFLD大鼠肝脏代谢组学研究。首先建立肝匀浆液UPLC-Q-TOF代谢组学分析方法,通过建立的分析方法筛选出最佳的肝脏匀浆液前处理方法：以乙腈：双重蒸馏水=8：2(V/V)为提取溶剂,在冰上先用组织匀浆机将肝组织捣碎,然后用玻璃匀浆管充分研磨,研磨液再放入超声仪中超声提取10min,最后将提取液在4℃下,14000rpm离心5min,取上清液,用双重蒸馏水稀释至乙腈含量为30%。所有样品按筛选出前处理方法连续采集完所有数据。经数据多元统计分析后,共找出103个差异代谢物,其中在代谢通路中出现的化合物有26种。代谢通路上的差异化合物变化规律表明,MCG组肝细胞中外源性甘油酯类、胆固醇均增加,内源性合成的TG增加,同时线粒体脂肪酸β-氧化功能减弱,导致肝细胞内脂肪沉积,最终引发脂肪肝的发生。经EGCG干预后,通路上很多内源性代谢物出现逆向回落,表明EGCG通过抑制内源性TG合成和增强脂肪酸β-氧化,从而达到降低肝细胞脂肪沉积,进而改善NAFLD的效果。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-17
第一章绪论  17-29
  1 非酒精性脂肪肝国内外研究概况  17-22
    1.1 NAFLD的病因  17-18
      1.1.1 营养性因素  17
      1.1.2 内分泌激素紊乱因素  17-18
      1.1.3 化学性致病因素  18
      1.1.4 生物性致病因素  18
      1.1.5 体重下降过快  18
      1.1.6 其他因素  18
    1.2 NAFLD的发病机制概述  18-19
    1.3 NAFLD的诊断技术  19-22
      1.3.1 常规生化指标检测  20
      1.3.2 细胞因子检测  20-21
      1.3.4 影像学检查  21
      1.3.5 基因诊断  21
      1.3.6 肝活检  21-22
  2 EGCG药理研究概况  22-24
    2.1 抗氧化作用  22
    2.2 抗衰老作用  22
    2.3 类胰岛素作用  22-23
    2.4 胰岛素分泌增加,加强胰岛素敏感性  23
    2.5 抑制α-葡萄糖苷酶活性  23
    2.6 抗肿瘤作用  23
    2.7 保护心脑血管活性  23-24
    2.8 抗紫外线辐射作用  24
  3 代谢组学研究概况  24-27
    3.1 代谢组学的概念和特点  24-25
    3.2 代谢组学的研究方法  25
    3.3 肝脏疾病中代谢组学的研究现状  25-27
  4 研究目的与意义  27
  5 主要研究内容及技术路线  27-29
    5.1 主要研究内容  27
    5.2 技术路线  27-29
第二章 EGCG干预非酒精性脂肪肝大鼠药效学分析  29-40
  1 材料和方法  29-32
    1.1 材料  29-30
      1.1.1 实验动物  29
      1.1.2 喂养饲料  29-30
      1.1.3 实验样品及配制方法  30
    1.2 药品与试剂  30
    1.3 实验仪器  30
    1.4 实验方法  30-32
      1.4.1 非酒精性脂肪肝大鼠MCG的建立  30
      1.4.2 实验动物分组及给药方法  30-31
      1.4.3 样本采集  31
      1.4.4 指标测定和切片制作  31-32
      1.4.5 数据处理  32
  2 结果与分析  32-36
    2.1 一般指标结果  32-33
      2.1.1 日常情况观察  32
      2.1.2 各组大鼠的初末体重,肝湿重、脾湿重和肝指数、肝脾比值  32-33
    2.2 主要血清生化指标  33-34
    2.3 主要肝匀浆生化指标  34-35
    2.4 形态学指标  35-36
      2.4.1 肝脏肉眼观察结果  35
      2.4.2 肝脏组织病理切片  35-36
  3 讨论与结论  36-40
    3.1 EGCG能有效调节血脂代谢紊乱和抑制肝脏中甘油三酯的合成  37-38
    3.2 EGCG能降低氧化应激所致的脂质过氧化损伤,改善肝脏炎症反应的程度  38-39
    3.3 结论  39-40
第三章 EGCG干预非酒精性脂肪肝大鼠尿液代谢组学研究  40-52
  1 材料和方法  40-43
    1.1 试剂及仪器  40
      1.1.1 主要试剂  40
      1.1.2 主要仪器  40
    1.2 尿液的收集与保存  40-41
    1.3 尿液UPLC-ESI-Q-TOF检测与分析  41-43
      1.3.1 尿液样品前处理  41
      1.3.2 上样样品的制备方法  41
      1.3.3 尿液样品UPLC-ESI-Q-TOF数据采集及分析  41-42
      1.3.4 数据处理  42-43
  2 结果与分析  43-49
    2.1 尿液代谢组学分析平台的建立  43
    2.2 样品不同制备方法的比较  43-44
    2.3 样品数据模式识别分析和尿液中潜在生物标记物的确定及EGCG的影响  44-48
    2.4 潜在标志物二级质谱结构确认  48-49
  3 讨论  49-52
    3.1 数据处理的流程及注意事项  49-50
    3.2 尿液中潜在生物标记物代谢通路的探讨  50-52
第四章 EGCG干预非酒精性脂肪肝大鼠肝脏代谢组学研究  52-69
  1 材料和方法  52-54
    1.1 试剂及仪器  52
      1.1.1 主要试剂  52
      1.1.2 仪器设备  52
    1.2 肝脏组织采集  52-53
    1.3 肝组织匀浆液UPLC-ESI-Q-TOF检测与分析  53-54
      1.3.1 肝组织匀浆液样品前处理  53
      1.3.2 肝组织匀浆液样品UPLC-ESI-Q-TOF数据采集及分析  53-54
      1.3.3 数据分析  54
  2 结果与分析  54-66
    2.1 肝组织匀浆样品不同前处理方法的比较  54
    2.2 样品数据模式识别分析和肝组织匀浆液中差异代谢物比较  54-66
  3 讨论  66-69
    3.1 肝组织匀浆液中差异代谢物代谢通路的探讨  66-67
      3.1.1 高脂饮食引起肝脏糖代谢通路的改变  66
      3.1.2 高脂饮食引起脂肪代谢的变化  66-67
    3.2 EGCG对代谢通路的影响  67-69
全文总结  69-70
  1 本文主要研究结果  69
    1.1 成功建立了SD大鼠的NAFLD模型,并对EGCG干预效果进行了药效学评价  69
    1.2 成功构建了UPLC-Q-TOF尿液代谢组学方法,并找到与NAFLD密切相关的11个潜在生物标志物  69
  2 本文主要创新点  69-70
    2.1 首次用代谢组学的方法研究EGCG对NAFLD的干预作用  69
    2.2 首次从糖脂代谢变化途径揭示EGCG干预NAFLD的机制  69-70
参考文献  70-78
致谢  78-79
作者简历  79

EGCG干预非酒精性脂肪肝大鼠代谢组学研究

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