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绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE的重组表达及初步活性鉴定
作 者: 林丹丹
导 师: 王宜强
学 校: 济南大学
专 业: 眼科学
关键词: 绿脓杆菌 鞭毛蛋白 FlgE 原核表达载体 角膜上皮细胞 炎性因子
分类号: R378.991
类 型: 硕士论文
年 份: 2013年
下 载: 9次
引 用: 0次
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内容摘要
目的:原核表达及纯化绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE并进行初步活性鉴定。方法:分析绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE的基因序列,设计带适当酶切位点的引物,用PCR方法扩增出FlgE的编码DNA序列,与大肠杆菌表达载体pET24a同时经NdeI/HindIII双酶切、纯化及连接后构建pET24a-FlgE原核表达质粒,挑选重组阳性质粒经DNA测序确认序列正确,转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达条件优化,使重组质粒表达目的蛋白,采用组氨酸标签亲和层析等法对目的蛋白进行纯化,通过SDS-PAGE对纯化后蛋白分子量进行鉴定,用试剂盒进行去内毒素化处理。在体外培养人角膜上皮细胞系细胞,加入纯化的FlgE重组蛋白,培养4小时后应用实时定量PCR检测各种相关的炎性因子以反映FlgE蛋白活性。结果:可用于大肠杆菌表达系统的重组pET24a-FlgE构建成功,其编码的蛋白在BL21中获得高效表达,当诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷浓度为1mmol/L,在16℃、225r/m振荡培养20小时时,诱导目的蛋白表达量最高,经纯化、去内毒素处理和SDS-PAGE分子量鉴定,获得纯化的重组FlgE蛋白。角膜上皮细胞用20μg/mL FlgE处理后,细胞内炎性相关分子IL-6和IL-8的表达量明显上升,而灭活的FlgE蛋白则丧失该刺激活性。结论:获得纯化的重组绿脓杆菌鞭毛蛋白FlgE,且可刺激角膜上皮细胞上调炎性因子IL-6、IL-8的表达。
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全文目录
研究生导师介绍 5-7 摘要 7-8 Abstract 8-10 主要符号表 10-11 引言 11-13 第一章 材料和方法 13-27 1.1 实验材料 13-18 1.2 方法 18-27 第二章 结果 27-30 2.1 FlgE 基因的扩增以及表达质粒的构建 27 2.2 重组 FlgE 的表达及纯化 27-29 2.3 重组 FlgE 促进 HCEC 分泌炎性因子 29-30 第三章 讨论 30-32 参考文献 32-34 综述 34-45 参考文献 40-45 攻读学位期间的研究成果 45-46 致谢 46
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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学微生物学(病原细菌学、病原微生物学) > 病原细菌 > 其他 > 蓝(绿)脓假单胞菌
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