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硫化氢对缺氧/再复氧大鼠心肌细胞内活性氧水平的影响

作　者: 孙伟华
导　师: 朱依纯
学　校: 复旦大学
专　业: 生理学与病理生理学
关键词: 硫化氢 心肌细胞 缺氧 再复氧 活性氧 线粒体 锰超氧化物歧化酶
分类号: R363
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


缺血/再灌注损伤是一种重要的病理生理学现象,可以发生在多种器官和组织上。心肌对氧气需求量大,容易发生缺血/再灌注损伤。心肌缺血再灌注损伤是一个临床难题,常出现在心脏冠状动脉闭塞后血流恢复的阶段,与血栓溶解、血管成形术和冠状动脉旁路手术有关,因为这些手术通常都需要建立血液回流来减少严重的心肌缺血对心脏造成的损伤。目前,心肌缺血/再灌注损伤的发生机制虽未完全阐明,但是缺血/再灌注时发生氧化应激、活性氧(reactive oxygen species, ROS)大量产生被认为是心肌缺血/再灌注损伤的一个重要机制。日益增多的研究表明,ROS可以攻击细胞蛋白质、脂质和核酸分子,引起蛋白质、脂质和核酸的结构和功能改变,从而导致细胞损伤,直至坏死。近年来,硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)被认为是一种新的气体信号分子而被广泛研究。人们发现生物机体产生内源性的H2S,其可以在多种生理、病理生理条件下发挥多样的作用。研究表明,H2S在离体心肌细胞和心脏模型上均表现出对抗缺血/再灌注损伤、保护心肌的作用。H2S保护心肌作用的机制还不是十分明了,现有研究提出的机制有NO释放、蛋白激酶C激活和ATP敏感性钾通道开放等。另外,有报告指出,H2S保护心肌的作用起码部分是通过对氧自由基和过氧化氢的直接清除实现的。受此观点的启发,我们尝试探讨H2S是否通过调节ROS的生成和/或清除作用,从而来降低缺血/再灌注心肌细胞内ROS水平,实现保护心肌作用的。在本实验中,我们用缺氧/再复氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)模拟缺血/再灌注,研究在此条件下H2S对新生大鼠心肌细胞ROS水平的影响。对照组的原代新生大鼠心肌细胞在正常的培养条件下孵育,而H/R组和H/R+NaHS组心肌细胞在无血清培养基中孵育,同时接受低氧411/复氧1h处理。在H/R+NaHS组,缺氧前30min用不同浓度的NaHS(H2S供体)孵育处理心肌细胞,NaHS处理一直维持到复氧60min。复氧阶段各个时间点的胞内ROS水平使用DCFH探针检测。60min复氧结束时,提取心肌细胞线粒体样本用于线粒体电子传递链复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性的检测。使用酶活性检测试剂盒检测心肌细胞内抗氧化酶的活性,这些抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(hydrogen peroxidase, CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase, GPx)。另外,使用Western-blot检测了SOD和PPARy的在心肌细胞内的表达水平。结果表明,在复氧开始后5min到60min,外源性的H2S抑制了胞内ROS水平的上升。在使用的NaHS各剂量内,50μmol/L为最佳效应剂量。和对照组相比,H/R组和H/R+NaHS组心肌线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ活性明显下降,提示缺氧／再复氧损伤了这些复合体。值得注意的是,NaHS可以显著降低在缺氧／再复氧条件下已经受损的复合体IV活性。抗氧化酶的活性检测发现,和内源性抗氧化酶和对照组相比,H/R和H/R+NaHS组心肌细胞内CAT和GPx的活性没有明显改变,而H/R组心肌细胞SOD活性明显下降,NaHS处理可以使之恢复。我们发现NaHS恢复H/R条件下SOD活性的机制之一可能是：NaHS可以直接与SOD蛋白结合,促进SOD清除超氧阴离子的能力。此外,我们发现H2S可以上调Mn-SOD的蛋白表达,但对CuZn-SOD无此作用。为了研究H2S促Mn-SOD蛋白表达的机制,我们检测Mn-SOD基因重要的转录决定因子——PPARy的表达水平,发现其不受H2S影响。总之,以上结果表明,H2S可以降低缺氧／再复氧时心肌细胞内ROS水平,其保护心肌的作用机制可能涉及到H2S对线粒体电子传递链复合体IV功能的调节和对Mn-SOD的活性和蛋白表达的上调。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-8
前言  8-12
第一部分 硫化氢对缺氧/再复氧大鼠心肌细胞内ROS生成的影响  12-39
  材料方法  12-27
  结果  27-33
  讨论  33-39
第二部分 硫化氢对大鼠心肌细胞内源性抗氧化剂的酶活性的影响  39-66
  材料方法  39-53
  结果  53-62
  讨论  62-66
小结  66-67
参考文献  67-77
综述  77-92
  参考文献  85-92
致谢  92-93

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 病理学 > 病理生理学
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