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百令胶囊对放射性肺损伤防护作用的基础与临床研究

作　者: 衷敬华
导　师: 张积仁
学　校: 南方医科大学
专　业: 肿瘤学
关键词: 放射性肺损伤 SD大鼠百令胶囊细胞因子基质金属蛋白酶中医临床症状积分生活质量临床试验
分类号: R730.55
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：放射性治疗(radioactive therapy,RT)是肺癌、乳腺癌、食管癌等胸部肿瘤患者最主要的治疗手段之一。肺是人体中辐射较为敏感的器官,放射治疗可使靠近肿瘤周围的肺组织受到超过其生物效应阈值的放射线剂量而导致不同程度的细胞损伤。放射性肺损伤(radio-pulmonary lesion,RPI)是胸部肿瘤放射治疗最为常见并发症之一,临床上通常有两种表现形式,早期急性放射性肺炎和后期放射性肺纤维化[1]。放射性肺损伤限制了肿瘤的放疗剂量,也使放疗效果大大降低,其发病机制尚不清楚,且缺乏有效的预测指标,已成为有效治疗胸部肿瘤的一大难题。一旦发生放射性肺损伤,目前临床上最常用的治疗方法是使用肾上腺皮质激素联合抗生素[2]。虽然大剂量激素可暂时有效缓解症状,抑制肺纤维化的发展,但容易产生诸多并发症。放射性肺损伤严格意义上来讲是无菌性炎症[3],其一旦发生往往不可逆转,因此预防比治疗更重要。近年研究表明放射性肺损伤的发生发展是一个有多种细胞参与,多种细胞因子和炎症介质相互作用发生的复杂生物分子过程[4]。由于其病理机制的多环节及复杂性,单一环节或靶向的干预效果尚不理想,临床上仍然缺乏防治放射性肺损伤的特异有效药物。阿米福叮(amifostine,AMSF)是目前公认的世界上唯一比较成熟应用于临床的放射性肺损伤防护剂[5][6]。遗憾的是,阿米福叮价格昂贵,很少患者能够负担,而且可能存在较大毒副作用，临床上难以广泛应用。因此,寻找更为高效、低毒、经济的放射性肺损伤防护剂就显得愈加重要了。中医药是我国的传统瑰宝,中药具有整体调节,多成分与多环节的作用特点,对病理复杂的疾病可发挥综合优势,研究及实践证明中医药在放射性肺损伤具有良好作用与发展前景。大量的临床研究表明，中医药防治放射性肺炎及肺纤维化疗效确切,能有效改善患者的临床症状,提高生活质量,降低死亡率,因此探讨中医药防治放射性肺损伤具有十分重要的现实意义。百令胶囊(Bailing Capsule,BC)是人工培养的冬虫夏草菌丝,经生物工程方法制成的中药制剂,它与天然虫草的化学组成与功效基本一致,几十年来的研究已经证实,百令胶囊在调节机体免疫、抗肿瘤、抗辐射等方面发挥了一定的作用,研究证实,百令胶囊能显著降低纤维化的重要细胞因子转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β),对改善肾脏及肝脏纤维化方面有一定疗效。目前尚未发现百令胶囊防治放射性肺损伤的作用机制研究的报道。本课题分两部分,第一部分为观察百令胶囊防治放射性肺损伤大鼠模型的基础研究。首先复制放射性肺损伤的大鼠模型,以促炎症反应细胞因子和促纤维化细胞因子为切入点,从放射性肺炎及肺纤维化的基础证候着手,以百令胶囊作为养阴清肺的基本药方,观察百令胶囊对大鼠肺系数、肺组织病理形态的影响；对大鼠肺组织超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的影响；对大鼠肺组织基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase-2,MMP-2)及其组织抑制剂(Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinases-2,TIMP-2)蛋白质表达的影响；尤其是对大鼠血浆促炎症反应细胞因子肿瘤坏死因子a (tumor necrosis factor α,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)及促纤维化细胞因子TGF-β1的影响。第二部分为观察百令胶囊对胸部肿瘤患者放射性肺损伤的临床研究。通过观察胸部肿瘤患者的放射性肺炎发生率、临床症状积分、生活质量及血浆TGF-β1水平以评价百令胶囊对放射性肺损伤的防治效果,为进一步寻找防治放射性肺损伤相关靶点,探求其可能的作用机制并为临床使用提供确切可行的科学依据。如果能够证实百令胶囊确实具有放射性肺损伤防护剂之功效,那么对开发适合我国国情的辐射防护剂将具有重要意义,对肿瘤放射治疗学的发展乃至核工业的发展,都将起到积极的推动作用。方法：第一部分(基础研究)：将141只6周龄清洁级雄性SD大鼠,随机分为正常对照组(对照组)、单纯放射模型组(模型组)、百令胶囊预防组(百令预防组)、百令胶囊治疗组(百令治疗组)、地塞米松治疗组(地塞米松组),其中正常对照组21只,其它各组均为30只。各组均给予X射线全胸单次照射20Gy,正常对照组除外。百令胶囊用生理盐水溶解成一定浓度混悬液。正常对照组、模型组于造模后第二天起予等容积的生理盐水灌胃,百令治疗组灌服百令胶囊混悬液,地塞米松组予灌服地塞米松混悬液,每日1次。百令预防组则于照射前2周起开始灌服百令胶囊混悬液。每组分别于2、4、6周不同时间点随机处死大鼠,正常对照组每组7只,其它各组均为10只,腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉大鼠,心脏采血5ml,置肝素抗凝管,4℃3000r/min离心10min,分离血浆,置-20℃冰箱保存待用。采集大鼠肺组织,称重,计算肺系数的变化；HE染色、Masson染色光镜下观察大鼠肺组织病理形态学变化,采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性,采用硫代巴比妥酸化学比色法测定MDA含量,ELISA法检测大鼠血浆TNF-α、IL-6及TGF-β1含量的变化,免疫组化法观察大鼠肺组织MMP-2,TIMP-2蛋白表达的变化。第二部分(临床研究)：观察了从2012年1月至2012年8月来源于赣南医学院第一附属医院肿瘤科接受胸部肿瘤放射治疗的患者,共观察38例,随机分为两组,百令胶囊组(19例)：放射同时服用百令胶囊,从放疗第一天开始服用,按500mg/kg,口服,分3次/日,连续服至放疗结束后一个月。对照组(19例)：单纯放疗。观察放射性肺炎发生率、中医临床症状积分评定、生活质量及TGF-β1水平等指标。结果：第一部分(基础研究)：(1)在照射后1周至4周各组呈现急性炎症反应,其中10Gy、15Gy、20Gy组大鼠全部存活,25Gy组大鼠在照射后2周内相继死亡。结合观察大鼠的一般状态,以20Gy最为典型,提示能在较短时间内成功复制大鼠放射性肺损伤模型最佳照射剂量为20Gy,为今后研究中医药防治放射性肺损伤的作用机制及防治药物的筛选最佳照射剂量提供了实验基础。(2)百令胶囊可显著降低放射性肺炎大鼠肺系数(P<0.01)。其中百令预防组作用优于百令治疗组。百令预防组、百令治疗组、地塞米松组各组间比较差异有统计学差异(P<0.05)。肺组织病理学形态观察表明,第2、4、6周,百令预防组、百令治疗组与模型组比较,肺泡充血、渗出、出血及炎性细胞侵润等方面程度较轻；百令治疗组、百令预防组与地塞米松组比较,炎性程度明显较轻；第2周地塞米松组肺泡隔充血,出血与模型组比较无差别,但炎性细胞浸润相对较轻,4、6周差别不明显。(3)百令预防组、百令治疗组、地塞米松组2、4、6周大鼠肺组织中SOD活性均高于模型组(P<0.01),MDA含量均低于模型组(P<0.01)。其中,百令预防组SOD活性高于百令治疗组、地塞米松治疗组(P<0.01)。百令治疗组高于地塞米松组(P<0.05)。：百令预防组MDA含量低于百令治疗组、地塞米松治疗组(P<0.01),百令治疗组低于地塞米松组(P<0.05)。(4)百令预防组、百令治疗组、地塞米松组2、4、6周大鼠血浆中TNF-α、IL-6及TGF-β1低于模型组(P<0.01或P<0.05)。其中,百令预防组TNF-α、IL-6及TGF-β1低于百令治疗组、地塞米松组(P<0.01),百令治疗组TNF-α、IL-6及TGF-β1低于地塞米松组(P<0.01)。(5)百令预防组2、4、6周各时间点大鼠肺组织中MMP-2表达均低于模型组(P<0.01)；百令治疗组均低于模型组(2周P<0.01；4、6周P<0.05)。地塞米松治疗组各时间点与模型组比较差异不明显(P>0.05)。百令预防组大鼠肺组织中MMP-2表达2、4周明显低于百令治疗组(2周P<0.05,4周P<0.01),6周差异不显著(P>0.05)。百令预防组各时间点与地塞米松治疗组比较均有显著差异(2、4周P<0.01,6周P<0.05)。百令治疗组大鼠MMP-2的表达2周低于地塞米松治疗组(P<0.05),但4、6周差异不明显(P>0.05)。百令预防组大鼠肺组织中TIMP-2表达量明显低于模型组(2周P<0.05,4、6周P<0.01)。百令预防组与模型组比较TIMP-2表达2、4周下降不显著(P>0.05)、第6周差异显著(P<0.05)。地塞米松治疗组各时间点与模型组比较均无显著差异(P>0.05)。百令预防组2周与百令治疗组比较差异不明显(P>0.05),4、6周百令预防组明显低于百令治疗组(4周P<0.05,6周P<0.01)。百令预防组2周与地塞米松治疗组比较无明显差异((P>0.05),4、6周明显低于地塞米松治疗组组(P<0.01)。百令治疗组4周与地塞米松治疗组比较无明显差异(P>0.05),6周百令治疗组低于地塞米松治疗组(P<0.05)。第二部分(临床研究)：(1)在放射性肺炎发生率方面,胸部肿瘤放疗患者放疗结束6周后,百令组放射性肺炎的总发生率显著低于对照组(P<0.05)。(2)在中医临床症状积分评定方面,百令组治疗咳嗽、咳痰、痰中带血、胸闷气短、胸痛和五心烦热等症状方面,在治疗后3周和6周后较第1周显著改善,(P<0.05)；百令组在放射后第3周相与对照组比较,在咳嗽、咳痰、痰中带血、胸闷气短、胸痛较其有显著改善(P<0.05)；在放射后第6周相与对照组比较,在咳嗽、咳痰、痰中带血、胸闷气短较其有显著改善(P<0.01)。(3)在生活质量评定方面,百令组在生活质量的改善、稳定方面均高于对照组,生活质量降低低于对照组,百令组有效率高于对照组,差异有显著性(P<0.05)。(4)在放疗患者血浆TGF-β1水平比较方面,百令组胸部放疗患者血浆TGF-β1水平显著低于对照组,(P<0.01),放疗6周时血浆TGF-β1水平显著低于对照组,(P<0.01)。结论：第一部分(基础研究)：(1)本实验提示制作肺损伤模型最佳照射剂量为20Gy。(2)百令胶囊对放射性肺损伤大鼠有一定的防治效果。其防治作用可能通过以下途径实现：a、增强大鼠肺组织SOD的活性,减少MDA含量；b、抑制血浆促炎症因子IL-6、TNF-α及和促纤维化细胞因子TGF-β1的释放；c、降低放射性肺损伤大鼠肺组织MMP-2、 TIMP-2蛋白质表达,调节MMP-2/TIMP-2的平衡。百令胶囊能从不同程度上抑制或减轻肺泡的炎性反应,并能抑制肺纤维化的进程,从多途径有效保护肺组织从而减轻损伤,且预防优于治疗,防治效果优于地塞米松,未发现任何副作用。第二部分(临床研究)：百令胶囊对胸部肿瘤患者放射性肺损伤有一定的防治效果。其防治作用主要表现以下方面：a、百令组能降低胸部肿瘤患者放射性肺炎发生率；b、降低TGF-β1水平；c、降低中医临床症状积分评定；d、改善生活质量。

全文目录

摘要  3-9
ABSTRACT  9-19
第一部分：百令胶囊对放射性肺损伤防护作用的基础研究  19-81
  研究背景  19-22
  参考文献  22-26
  实验一制作大鼠放射性肺损伤模型的最佳照射剂量筛选研究  26-31
    摘要  26
    关键词  26-27
    1 材料  27
    2 方法  27
    3 结果  27-28
    4 讨论  28-29
    参考文献  29-31
  实验二百令胶囊对放射性肺损伤大鼠肺系数、肺组织病理形态的影响及放射性肺损伤模型的鉴定  31-46
    摘要  31
    关键词  31-32
    1 材料  32
    2 方法  32-34
    3 结果  34-42
    4 讨论  42-44
    参考文献  44-46
  实验三百令胶囊对放射性肺损伤大鼠肺组织SOD活性、MDA含量的影响  46-53
    摘要  46
    关键词  46-47
    1 材料  47
    2 方法  47-48
    3 结果  48-51
    4 讨论  51-52
    参考文献  52-53
  实验四百令胶囊对放射性肺损伤大鼠血浆IL-6、TNF-α、TGF-β1的影响  53-65
    摘要  53
    关键词  53-54
    1 材料  54
    2 方法  54-55
    3 结果  55-60
    4 讨论  60-63
    参考文献  63-65
  实验五百令胶囊对放射性肺损伤大鼠肺组织MMP-2、T1MP-2蛋白表达的影响  65-81
    摘要  65
    关键词  65-66
    1 材料  66
    2 方法  66-68
    3 结果  68-77
    4 讨论  77-79
    参考文献  79-81
第二部分：百令胶囊对放射性肺损伤防护作用的临床研究  81-99
  2.1 材料与方法  81-87
    2.1.1 病例选择  81-82
    2.1.2 病例分组  82
    2.1.3 观察指标  82
    2.1.4 依据标准  82-86
    2.1.5 主要试剂  86-87
    2.1.6 统计学方法  87
  2.2 结果  87-94
    2.2.1 临床资料基本特征  87-88
    2.2.2 两组各级放射性肺炎发生率  88-92
    2.2.3 两组病例中医临床症状评分比较  92-93
    2.2.4 6周两组胸部放疗患者生活质量评分(KPS评分)比较  93
    2.2.5 两组胸部放疗患者血浆TGF-β1水平  93-94
  2.3 讨论  94-99
全文结论  99-100
综述一  100-111
  参考文献  107-111
综述二  111-118
  参考文献  115-118
攻读学位期间发表论文  118-119
英文缩略词表  119-120
致谢  120-121
统计学审稿证明  121-122

百令胶囊对放射性肺损伤防护作用的基础与临床研究

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