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青藤碱对RANKL和LPS诱导的破骨细胞的影响及作用机制研究

作　者: 贺龙刚
导　师: 刘叔文
学　校: 南方医科大学
专　业: 药理学
关键词: 青藤碱破骨细胞激活核因子κ B受体的配体脂多糖骨破坏
分类号: R285
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

骨代谢的稳定需要破骨细胞(osteoclasts, OCs)介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成作用间的动态平衡和偶联,在健康个体中,二者维持功能平衡,而平衡一旦打破则可能导致骨骼疾病的发生。骨破坏主要是由异常的OCs活化造成的,过度骨破坏可能导致一些常见疾病,如类风湿关节炎、骨关节炎、骨髓炎、牙周炎等。目前对于这些疾病的药物治疗相当有限,主要依赖于糖皮质激素、免疫抑制剂、抗生素或非甾体抗炎药,然而这些药物不能逆转骨质侵蚀,有的甚至有反作用。OCs是体内唯一负责骨吸收的细胞,靶向抑制OCs活化被认为是逆转骨破坏最有效、最直接的治疗策略,目前已经成为该领域的研究热点。OCs起源于骨髓单核-巨噬细胞谱系细胞,在体内必须依赖于一些诱因诱导分化发育为多核的成熟OCs。目前认为最直接活化OCs的内源性分子是激活核因子NF-κB受体的配体(receptor activator of nuclear kappa B ligand, RANKL)。 RANKL通过和OCs膜上受体RANK结合,募集形成TRAF6和c-Src复合体,激活下游信号通路(NF-κB、MAPK和Ca2+通路)通过胞内信号传导途径激活核转录因子NF-κB、AP-1和NFATc1,激活OCs相关基因表达,例如抗酒石酸碱性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase, TRACP),金属基质蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9),整合素β3(integrinβ3)和组织蛋白酶K (cathepsinK),促进OCs分化,增强骨吸收活性,抑制其凋亡,最终导致OCs数量增多、功能亢进。脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)被认为是导致慢性G-菌感染骨丢失的最主要介质,被认为与诱导OCs活化密切相关,其诱导机制目前认为包括：通过诱导成骨细胞中RANKL的表达来控制OCs的分化和激活；通过刺激巨噬细胞产生TNF-α,IL-1和IL-6等炎症因子以及延长OCs的生命周期。青藤碱是传统抗风湿中药青风藤中的主要活性成分。具有明显抗风湿、抗炎、免疫抑制等药理作用。其相关制剂在临床上对各种风湿病具有确切疗效。尽管相关研究发现青藤碱具有降低骨破坏程度的效果,但是否能调控OCs仍未见有报道。本课题以青藤碱为研究对象,利用体外RANKL和LPS诱导OCs体系及体内Mt诱导的佐剂性关节炎骨破坏模型和LPS诱导的急性颅骨骨破坏模型,探讨青藤碱对OCs的调节作用及分子机制。主要内容包括三部分：1.青藤碱对RANKL诱导的OCs的影响；2.青藤碱对RANKL诱导的OCs的作用机制；3.青藤碱对LPS诱导的RAW-OCL的影响及机制。实验方法：1)通过CellTiter-Glo法和CCK-8法考察不同浓度青藤碱(0.125、0.25、0.5、1mM)干预不同时间(6h、24h、48h、5d)对RAW264.7细胞的生存影响,确定合适的体外用药浓度。利用体外RANKL诱导RAW264.7细胞形成OCs体系,通过TRACP染色计数评价青藤碱(0.25、0.5、1mM)对OCs形成和生存的影响；通过骨片吸收实验对骨凹陷和骨吸收面积统计分析评价青藤碱(0.5、1mM)3天内对成熟OCs骨吸收功能的影响；利用标记FITC的鬼笔环肽染色评价青藤碱(1mM)6h内对OCs肌动蛋白环结构的影响；采用Real-Time PCR技术,检测青藤碱(0.25、0.5、1mM)对RANKL诱导的RAW264.7细胞相关基因TRACP,MMP-9,c-Src,Integrin β3和cathepsin K表达水平的影响。建立Mt诱导的佐剂性关节炎SD大鼠骨破坏模型,评价青藤碱(i.p.80mg/kg/day)和阳性药物雷公藤多甙片(i.g.2.5mg/kg/day)对模型动物足踝肿胀、骨破坏病理变化、OCs数量、骨参数(组织矿物质密度、骨矿物质密度、骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量,骨小梁分离度)及血清中相关细胞因子RANKL、骨保护素(osteoprotegerin, OPG)、TRACP5b和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)水平的影响。2)考察青藤碱对RANKL相关信号通路的影响,利用体外RANKL诱导RAW264.7细胞体系中,首先采用荧光报告基因技术,检测青藤碱对核转录因子NF-κB活化的影响；接着通过Western blot和免疫荧光实验,检测青藤碱对NF-κB信号通路相关分子(p65和IκBα)表达及p65核转位的影响；再通过RT-PCR和Western blot检测青藤碱对NF-κB上游分子(RANK和TRAF6)表达的影响。接下来我们通过Western blot和Ca2+探针Fluo-3AM标记考察了青藤碱对TRAF6下游MAPK信号通路分子(p38、ERK和JNK)磷酸化及200s内RANKL诱导OCs的Ca2+浓度变化。最后通过荧光报告基因技术检测青藤碱对核转录因子AP-1和NFAT活化的影响；再通过RT-PCR和Western blot检测青藤碱对AP-1相关分子(c-Fos、Fra-1和Fra-2)和NFATcl基因表达及c-Fos蛋白表达的调控。考察青藤碱对RANKL诱导的成熟OCs凋亡的影响,首先通过DNA Ladder分析不同浓度(0.25、0.5、1、2mM)青藤碱在不同时间段(12、24、36、48h)对OCs凋亡的影响；再通过Hochst33258染色评价0.5mM青藤碱在单用或联合Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO(10μM)时对OCs细胞核凋亡的影响。对于青藤碱诱导成熟OCs凋亡的信号通路,我们通过Western blot和检测不同浓度(0.25、0.5、1、2mM)青藤碱在不同时间段(12、24、36、48h)对活化的Caspase-3蛋白表达的影响,并利用Caspase-3酶活性比色法检测0.5和1mM青藤碱以及阳性对照药物喜树碱(4μM)在单用或联合Ac-DEVD-CHO (10μM)24h内对Caspase-3酶活性的影响。3)利用体外LPS诱导RAW264.7细胞形成RAW-OCLs体系,通过TRACP染色计数评价青藤碱(0.25、0.5、1mM)对RAW-OCLs形成和生存的影响；通过骨片吸收实验对骨凹陷计数评价青藤碱(0.25、0.5、1mM)对3天内对成熟RAW-OCLs骨吸收功能的影响；利用标记FITC的鬼笔环肽染色评价青藤碱(1mM)6h内对RAW-OCLs肌动蛋白环结构的影响；利用ELISA检测青藤碱(0.25、0.5、1mM)LPS诱导的RAW-OCLs释放TNF-a的影响；采用Real-TimePCR技术,检测青藤碱(0.25、0.5、1mM)对LPS诱导的RAW264.7细胞和成熟RAW-OCLs的TRACP,MMP-9,c-Src,Integrin03和cathepsin K基因表达影响。建立LPS诱导的C57BL/c小鼠急性颅骨骨破坏模型,通过HE染色和TRACP染色评价青藤碱(i.h.25、50、100mg/kg/day)对LPS诱导的颅骨破坏和OCs数量的影响,并通过ELISA检测血清中TNF-a水平。考察青藤碱对LSP诱导的RAW-OCLs作用机制,首先采用荧光报告基因技术,检测青藤碱对LPS诱导的RAW264.7细胞核转录因子NF-κB活化的影响；接着通过Western blot和免疫荧光实验,检测青藤碱对LPS诱导的RAW264.7细胞NF-κB信号通路相关分子(p65和[KB-α)表达及p65核转位的影响；再通过RT-PCR检测青藤碱对LPS诱导的RAW264.7细胞和成熟RAW-OCLs的NF-κB上游分子(TLR4和TRAF6)表达的影响,最后利用和Western blot检测青藤碱对LPS诱导的RAW264.7细胞TLR4和TRAF6蛋白表达的影响。接下来我们通过Western blot和Ca2+探针Fluo-3AM标记考察了青藤碱对LPS诱导的RAW264.7细胞的MAPK信号通路分子(p38、ERK和JNK)磷酸化及200s内RAW-OCLs的Ca2+浓度变化。最后通过荧光报告基因技术检测青藤碱对LPS诱导的RAW264.7细胞核转录因子AP-1和NFAT活化的影响；再通过RT-PCR检测青藤碱对LPS诱导的RAW264.7细胞和成熟RAW-OCLs的AP-1相关分子(c-Fos、Fra-1和Fra-2)和NFATcl基因表达的调控并利用Western blot检测RAW264.7细胞中c-Fos蛋白表达水平。实验结果：1)细胞生存实验发现除1mM青藤碱干预5d后(抑制率约50%,F=10.95,P<0.01),青藤碱(0-1mM)对RAW264.7细胞5天内生存未发现显著影响。通过TRACP染色发现0.25mM、0.5mM和1mM青藤碱能显著抑制体外RANKL诱导的OCs形成(F=65.08,P<0.01),0.5mM和1mM青藤碱能显著抑制OCs生存(F=91.08,P<0.01)；通过骨片吸收实验发现0.5mM和1mM青藤碱3d内能显著降低骨吸收面积(F=59.35,P<0.01)和骨凹陷(F=24.79,P<0.01),提示其抑制成熟OCs骨吸收功能。1mM青藤碱6h内能破坏OCs的肌动蛋白环结构,显著减少肌动蛋白环数量(t=8.628,P=0.0132)。青藤碱能呈剂量依赖性抑制RANKL诱导的TRACP(F=35.99, P<0.01), MMP-9(F=63.30, P<0.01), c-Src(F=21.80, P<0.01),Integrin β3(F=6.839, P=0.0134)和cathepsin K (F=5.052, P=0.0298)基因表达,尤其对c-Src,MMP-9,TRACP的表达在0.25mM时仍具有显著性差异。80mg/kg/day青藤碱阻断Mt诱导的关节炎大鼠足肿胀发展,降低关节滑膜部位的炎症侵润并显著降低OCs数量(F=16.61,P<0.01),提高骨密度,显著升高骨参数TMD(F=12.34,P<0.01)、BMD(F=7.066,P<0.01)、BV/TV (F=13.22,P<0.01)、Tb.Th(F=18.69,P<0.01)、Tb.N(F=16.67,P<0.01),降低Tb.Sp(F=40.26,P<0.01),显著降低血清中RANKL含量(F=33.58,P<0.01),RANKL/OPG比值(F=12.81,P<0.01)和TRACP酶活力(F=9.789,P<0.01),升高OPG含量(F=13.07,P<0.01)和ALP酶活性(F=38.66,P<0.01)。2)机制研究发现,青藤碱剂量依赖性抑制RANKL诱导的NF-κB报告基因表达,0.25mM时仍具有显著性差异(F=107.9,P<0.01)。青藤碱通过抑制IκB-α降解和p65入核表达从而抑制RANKL诱导NF-κB信号通路活化,并显著抑制其上游分子TRAF6基因(F=32.82,P<0.01)和蛋白表达。青藤碱选择性抑制RANKL诱导的TRAF6下游分子JNK和p38磷酸化及OCs的Ca2+内流。青藤碱剂量依赖性抑制RANKL诱导的NFAT(F=93.23,P<0.01)和AP-1(F=25.70,P<0.01)报告基因表达,0.25mM时仍具有显著性差异。0.5和1mM青藤碱均能显著抑制AP-1相关分子c-Fos(F=14.96,P<0.01)、Fra-1(F=36.00,P<0.01)、Fra-2(F=12.71,P<0.01)和NFATcl(F=10.82,P<0.01)基因表达并抑制c-Fos蛋白表达。0.5mM青藤碱干预12-48h和0.25-2mM青藤碱干预24h均导致RANKL诱导的成熟OCs出现DNA梯状条带,其中以0.5mM作用24h最为显著；通过Hochst33258染色也发现0.5mM青藤碱干预24h后导致大量OCs细胞核出现典型断裂,聚集和浓缩,该现象部分被Ac-DEVD-CHO阻断,提示青藤碱通过激活Caspase-3诱导OCs凋亡。通过Western blot试验发现0.5mM青藤碱干预成熟OCs12-48h均能诱导活化的Caspase-3亚基表达上升,0.5-2mM青藤碱干预24h均能诱导活化的Caspase-3亚基表达上升。同时通过比色法发现0.5mM和1mM青藤碱均能显著提高OCs的Caspase-3酶活力(F=54.26,P<0.01),但能被Ac-DEVD-CHO完全阻断。3)通过TRACP染色发现0.5mM和1mM青藤碱能显著抑制体外LPS诱导的RAW-OCLs形成(F=41.29,P<0.01)和生存(F=53.74,P<0.01)。通过骨片吸收实验发现0.5mM和1mM青藤碱3d内能显著RAW-OCLs形成的骨凹陷数量(F=37.01,P<0.01),提示其对于LPS诱导的OCLs的骨吸收活性有抑制作用。1mM青藤碱6h内能显著降低LPS诱导的RAW-OCLs的肌动蛋白环结构百分率(t=12.73,P<0.01)。0.25-1mM青藤碱能呈剂量依赖性显著降低LPS诱导的TNF-a释放(F=38.08,P<0.01)。1mM青藤碱对LPS诱导的RAW264.7前体细胞的TRACP,(F=20.97,P<0.01)、MMP-9(F=29.99,P<0.01)、c-Src(F=21.83,P<0.01)、Integrin β3(F=5.363,P=0.0256)和cathepsin K(F=13.13,P<0.01)均具有显著抑制作用；0.5mM时除Integrin β3外,也均具有显著抑制作用；0.25mM时对c-Src、cathepsin K和MMP-9仍具有显著抑制作用。对成熟OCLs各相关基因表达,0.5mM和1mM青藤碱对TRACP,(F=418.6, P<0.01)、MMP-9(F=61.85,P<0.01)、c-Src(F=387.0,P<0.01)、Integrin β3(F=176.9, P<0.01)和cathepsin K (F=166.0, P<0.01)均具有显著抑制作用,尤其对TRACP、c-Src和MMP-9的表达在低浓度(0.25mM)时仍具有显著抑制效应。通过组织学图像分析,100和50mg/kg青藤碱能显著降低LPS诱导的小鼠颅骨骨破坏模型的炎症侵润面积(F=32.97,P<0.01)和TRACP+细胞数量(F=31.48,P<0.01),并且25,50,100mg/kg青藤碱均能显著降低血清中TNF-a含量(F=31.18,P<0.01)。机制研究发现,青藤碱剂量依赖性抑制LPS诱导的NF-κB报告基因表达,0.25mM时仍具有显著性差异(F=150.5,P<0.01)。青藤碱通过抑制RAW264.7细胞IκB-α降解和p65入核表达从而抑制LPS诱导NF-κB信号通路活化,并呈剂量依赖性抑制其上游分子TLR4(F=9.551,P<0.01)和TRAF6(F=71.64,P<0.01)基因和蛋白表达；而对于RAW-OCLs仅抑制TLR4(F=60.60,P<0.01)的基因表达而未发现影响TRAF6。青藤碱选择性抑制LPS诱导RAW264.7细胞的MAPK通路中p38和ERK磷酸化,并抑制RAW-OCLs的Ca2+内流,提示其可能影响下游转录因子AP-1和NFATcl。进一步研究发现青藤碱在0.25-1mM浓度下显著抑制LPS诱导的NFAT报告基因表达(F=98.74,P<0.01)；0.5和1mM时能显著抑制AP-1报告基因表达(F=181.5,P<0.01)。RT-PCR实验发现0.5和1mM青藤碱均能显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中AP-1相关分子c-Fos(F=72.34,P<0.01)、Fra-1(F=28.28,P<0.01)、Fra-2(F=33.08,P<0.01)和NFATc1(F=39.98, P<0.01)基因表达；在RAW-OCLs中0.25-1mM青藤碱对c-Fos(F=685.1,P<0.01)、Fra-2(F=3015,P<0.01)和NFATcl (F=3033, P<0.01)表达均具有显著抑制作用,但对Fra-1未发现显著抑制作用。青藤碱呈剂量依赖性抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中c-Fos蛋白表达。结论：1.青藤碱能抑制体外RANKL诱导RAW264.7细胞形成OCs,并抑制其骨吸收功能。2.青藤碱通过激活Caspase-3诱导OCs凋亡和破坏OCs的肌动蛋白环结构,从而抑制OCs生存。3.青藤碱能抑制Mt诱导的关节炎大鼠OCs活化,降低骨破坏,提高骨密度。4.青藤碱通过抑制上游TRAF6,一方面调控NF-κB信号通路抑制核转录因子NF-κB活化；另一方面通过抑制JNK和p38磷酸化和Ca2+内流,抑制核转录因子AP-1和NFATc1;最终下调OCs相关基因表达,抑制RANKL诱导的OCs活化。5.青藤碱能抑制体外LPS诱导的RAW-OCLs形成、生存和骨吸收功能。6.青藤碱能抑制LPS诱导的小鼠急性颅骨骨破坏模型的OCs活化并降低TNF-α水平。7.青藤碱通过调控上游TLR4和TRAF6,影响NF-κB、MAPK信号通路和Ca2+内流,抑制核转录因子NF-κB、AP-1和NFATc1,下调OCs相关基因表达,降低TNF-a释放,最终抑制LPS诱导的OCLs活化。

全文目录

摘要  3-10
ABSTRACT  10-19
前言  19-24
第一章青藤碱对RANKL诱导的破骨细胞的影响  24-46
  1.1 材料  24-25
  1.2 实验方法  25-33
    1.2.1 青藤碱对RAW264.7细胞细胞生存作用  25-26
    1.2.2 青藤碱对RANKL诱导的破骨细胞形成的影响  26
    1.2.3 青藤碱对RANKL诱导的成熟破骨细胞生存的影响  26-27
    1.2.4 青藤碱对RANKL诱导的破骨细胞骨吸收活性的影响  27
    1.2.5 青藤碱对RANKL诱导的破骨细胞肌动蛋白环结构的影响  27
    1.2.6 青藤碱对RANKL诱导的破骨细胞相关基因表达的影响  27-31
    1.2.7 青藤碱对结核分枝杆菌诱导的佐剂性关节炎大鼠的影响  31-32
    1.2.8 统计方法  32-33
  1.3 实验结果  33-46
    1.3.1 青藤碱对RAW264.7细胞细胞生存作用  33
    1.3.2 青藤碱抑制RANKL诱导的破骨细胞形成与生存  33-35
    1.3.3 青藤碱抑制RANKL诱导的破骨细胞骨吸收活性  35-36
    1.3.4 青藤碱破坏RANKL诱导的破骨细胞肌动蛋白环结构  36-38
    1.3.5 青藤碱抑制RANKL诱导的破骨细胞相关基因表达  38-39
    1.3.6 青藤碱抑制佐剂性关节炎大鼠模型病变及破骨细胞生成  39-42
    1.3.7 青藤碱对佐剂性关节炎大鼠模型相关骨参数的影响  42-44
    1.3.8 青藤碱对佐剂性关节炎大鼠模型骨相关因子的影响  44-46
第二章青藤碱对RANKL诱导的破骨细胞的作用机制  46-72
  2.1 材料  46-47
  2.2 实验方法  47-56
    2.2.1 青藤碱对RANKL诱导的NF-κB信号通路的影响  47-50
    2.2.2 青藤碱对RANKL诱导的AP-1/NFATc1信号通路的影响  50-53
    2.2.3 青藤碱对RANKL诱导的成熟OCs凋亡的影响  53-55
    2.2.4 统计方法  55-56
  2.3 实验结果  56-72
    2.3.1 青藤碱抑制RANKL诱导的NF-κB信号通路  56-61
    2.3.2 青藤碱抑制RANKL诱导的AP-1/NFATc1信号通路  61-66
    2.3.3 青藤碱促进RANKL诱导的成熟OCs凋亡  66-72
第三章青藤碱对LPS诱导的RAW-OCL的影响及机制  72-104
  3.1 材料  72-73
  3.2 实验方法  73-82
    3.2.1 青藤碱对LPS体外诱导的RAW-OCLs的影响  73-75
    3.2.2 青藤碱对LPS诱导的急性颅骨骨破坏小鼠模型的影响  75-76
    3.2.3 青藤碱对LPS诱导的NF-κB信号通路的影响  76-78
    3.2.4 青藤碱对LPS诱导的AP-1/NFATc1信号通路的影响  78-81
    3.2.5 统计方法  81-82
  3.3 实验结果  82-104
    3.3.1 青藤碱抑制LPS体外诱导的RAW-OCLs的形成、生存及活性  82-86
    3.3.2 青藤碱抑制LPS诱导的破骨细胞相关基因表达  86-88
    3.3.3 青藤碱抑制LPS诱导的急性颅骨骨破坏  88-91
    3.3.4 青藤碱抑制LPS诱导的NF-κB信号通路  91-97
    3.3.5 青藤碱抑制LPS诱导的AP-1/NFATc1信号通路  97-104
讨论  104-115
全文结论  115-116
参考文献  116-125
附录缩写词中英文对照表  125-127
成果  127-129
致谢  129-131
论文统计学合格证明  131

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