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雷公藤多苷联合人参皂苷对佐剂性关节炎大鼠的骨保护作用及机制探讨

作　者: 马华
导　师: 李振彬
学　校: 河北医科大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 佐剂性关节炎 骨破坏 MIF RANKL / OPG 雷公藤多苷 人参皂苷 配伍
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的:类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性炎症性疾病,以滑膜炎及伴随的进展性软骨和骨破坏为特征。其病因及发病机制尚不明确,未经治疗的类风湿关节炎的患者致残率较高,而骨破坏是RA致残的关键原因。目前证实对RA骨质破坏具有控制作用的治疗药物是以肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)拮抗剂为代表的缓解疾病的抗风湿性药物(Disease modifying antirheumatic drug,DMARDs),但该类药物的有效性有限,且毒副作用明显、价格昂贵。我们在复制胶原诱导关节炎/佐剂性关节炎(collagen-induced arthritis /adjuvant arthritis,CIA/AA)模型及成纤维样滑膜细胞培养等研究平台的基础上,观察了中药有效成分及其配伍(包括雷公藤多苷、雷公藤甲素、人参皂苷)对实验性关节炎及巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)表达的影响;开展了大鼠成纤维样滑膜细胞增殖及滑膜细胞MIF表达的血清药理学观察;进行了胶原诱导关节炎大鼠血清IL-1β、TNF-α与MIF表达的相关性分析及雷公藤有效成分的干预研究。本研究拟通过复制AA模型,探索MIF与骨破坏的相关性,以及中药有效成分配伍和中药有效成分与甲氨蝶呤(methotrexat,MTX)配伍的干预作用,为临床中药有效成分配伍治疗RA的骨破坏提供实验依据。方法:选择体重180g±20g的Wistar大鼠,雌雄各半。测量双侧足爪厚度后,用电子称测各组大鼠体重,随机分为正常对照组和AA组。正常对照组8只大鼠右后足跖部常规消毒,皮内注射注入0.1ml生理盐水;其余大鼠用同样的方法注射完全弗氏佐剂(0.1ml/只,卡介菌浓度10mg/ml),复制AA大鼠模型。造模后第21天将出现二次反应(arthritis index,AI≥5)的大鼠随机分为模型组、MTX组、雷公藤多苷组(tripterygium glycoside,TG)、人参皂苷组(ginsenoside,GS)、GS+MTX组、TG+GS组,每组8只。正常对照组和模型组给予生理盐水灌胃,其他组分别给予MTX、TG、GS、TG+GS、MTX+GS灌胃治疗,共21天。造模后第42d测量各组大鼠足爪厚度、体重;然后10%水合氯醛腹腔麻醉,腹主动脉取血留取血清。采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测模型鼠血清MIF和细胞核因子-κB受体活化因子RANK配体(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)、骨保护素(osteoprotegerin,OPG);放射免疫法检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、白介素-1(Interleukin-1,IL-1)水平。同时取双侧踝关节,经固定、脱钙、常规梯度脱水、浸蜡、包埋、切片。HE染色后光镜下观察组织切片病理改变;免疫组化法检测踝关节滑膜组织MIF与骨组织中RANKL、OPG的表达并进行半定量分析。统计学处理:所得数据均采用SPSS 13.0软件包进行统计学处理,所得结果以均数±标准差(±s)表示。各组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),采用LSD法进行组间两两比较。相关性分析采用Pearson相关检验。均以P<0.05认为有统计学意义。结果:1 TG+GS对各组大鼠一般情况的观察比较造模前各组体重差异无统计学意义(P>0.05)。造模后第21天,与正常对照组(23.38±4.44)相比,模型组(11.63±1.69)、MTX组(11.25±2.92)、TG组(11.38±3.85)、GS组(11.75±2.82)、GS+MTX组(13.13±4.32)、TG+GS组(13.75±2.87)体重增加值差异有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,MTX组、TG组、GS组、GS +MTX组、TG+GS组体重增加值差异无统计学意义(P>0.05)。造模后第42天,与模型组(6.12±2.53)相比,MTX组(8.87±4.64)和TG组(8.87±2.90)体重增加值差异无统计学意义(P>0.05),GS组(11.75±7.46)、GS+MTX组(16.25±3.69)、TG+GS组(20.00±7.09)体重增加值差异有统计学意义(P<0.05)。TG+GS组体重增加值最大。2 TG+GS对大鼠关节炎指数(AI)的变化造模后第21天,与模型组(10.00±1.69)相比,MTX组(9.63±1.41)、TG组(8.75±1.28)、GS组(10.13±1.73)、GS+MTX组(9.00±1.31)、TG+GS组(9.13±1.46)AI值差异无统计学意义(P>0.05)。造模后第42d,与模型组(2.38±0.52)相比,MTX组(5.13±1.46)、TG组(4.38±1.51)、GS组(4.13±1.36)、GS+MTX组(4.25±1.75)、TG+GS组(4.37±1.85)AI变化值差异有统计学意义(P<0.05)。MTX组最大,但TG+GS组与MTX组AI变化值差异无统计学意义(P>0.05)。3 TG+GS对AA大鼠双足爪肿胀抑制率的影响造模后第21天,与模型组(80.84±10.99,58.45±14.88)相比,TG组(79.00±9.77,59.95±15.66)、GS组(82.24±12.72,57.78±16.18)、MTX组(81.25±11.00,59.84±15.84)、GS +MTX组(81.27±11.43,57.85±16.02)、TG+GS组(83.82±13.81,59.66±15.76)双足爪肿胀率差异无统计学意义(P>0.05)。造模后第42天,MTX组双足平均肿胀抑制率为29.2%,TG组12.5%,GS组4.9%;GS +MTX组33.4%;TG+GS 29.6%。4 TG+GS对AA大鼠血清TNF-α、IL-1β、MIF、OPG、RANKL的影响4.1血清TNF-α(ng/ml)水平比较与正常对照组(0.87±0.11)相比,模型组(1.37±0.16)、MTX组(1.15±0.15)、TG组(1.17±0.17)、GS组(1.19±0.17)TNF-α水平差异有统计学意义(P<0.01),GS+MTX组(0.98±0.14)、TG+GS组(1.02±0.15)差异无统计学意义(P>0.05)。4.2血清IL-1β(ng/ml)水平比较与正常对照组(0.59±0.02)相比,模型组(0.18±0.03)、MTX组(0.16±0.02)、TG组(0.15±0.02)、GS组(0.16±0.03)、GS+MTX组(0.13±0.02)和TG+GS组(0.13±0.03)IL-1β水平差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比,MTX组、TG组、GS+MTX组、TG+GS组IL-1β水平差异有统计学意义(P<0.05)。GS+MTX组和TG+GS组IL-1β水平最低。4.3血清MIF(pg/ml)水平比较与正常对照组(349.54±16.94)相比,模型组(453.99±53.53)、MTX组(417.73±38.90)、TG组(431.49±41.08)、GS组(423.89±45.01)、GS+MTX组(408.28±33.82)、TG+GS组MIF水平(411.59±41.58)差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比,MTX组、GS+MTX组、TG+GS组差异有统计学意义(P<0.05),TG组、GS组差异无统计学意义(P>0.05)。GS+MTX组MIF水平最低,但TG+GS组与GS+MTX组差异无统计学意义(P>0.05)。4.4血清OPG(ng/ml)水平比较与正常对照组(69.41±3.36)相比,模型组(86.40±12.27)、TG组(79.14±8.90)、GS组(80.73±9.44)OPG水平差异有统计学意义(P<0.05),MTX组(74.80±6.80)、GS+MTX组(75.75±6.65)、TG+GS组(76.01±7.67)差异无统计学意义(P>0.05)。4.5血清RANKL(pg/ml)水平比较与正常对照组(21.25±1.57)相比,模型组(33.80±2.48)、MTX(27.13±2.74)、TG组(27.90±2.75)、GS组(28.11±2.89)、TG+GS组(24.55±2.10)RANKL水平差异有统计学意义(P<0.05),GS+MTX组(23.88±2.20)差异无统计学意义(P>0.05)。GS+MTX组RANKL水平最低,但TG+GS组与GS+MTX组差异无统计学意义(P>0.05)。4.6血清RANKL/OPG比值比较与正常对照组(0.28±0.06)相比,模型组(0.40±0.06)、MTX组(0.34±0.04)、TG组(0.36±0.05)、GS组(0.35±0.07)RANKL/OPG比值差异有统计学意义(P<0.05),GS+MTX组(0.32±0.06)、TG+GS组(0.32±0.02)差异无统计学意义(P>0.05)。4.7血清MIF水平与TNF-α、IL-1β、RANKL比值和关节炎病理积分的相关性MIF与TNF-α、IL-1β、RANKL、病理积分存在正相关关系(r =0.938,0.748,0.763,0.908,P<0.05)。5 TG+GS对AA大鼠踝关节病理变化的影响病理结果显示,正常对照组大鼠踝关节未见明显病变。模型组大鼠滑膜细胞增生,滑膜组织炎细胞浸润,滑膜衬里层增厚;滑膜与软骨连接区域滑膜细胞增生,软骨有损伤;骨小梁变细,软骨下骨和小梁骨出现骨侵蚀,破坏严重,甚至观察不到完整的骨小梁结构。各用药组病理改变较模型组减轻。与模型组(2.00±1.07)相比,GS+MTX组(0.88±0.83)病理积分差异有统计学意义(P<0.05),MTX组(1.88±1.07)、TG组(1.63±1.19)和GS组(1.88±0.99)、TG+GS(1.38±1.19)差异无统计学意义(P>0.05)。6 TG+GS对AA大鼠踝关节骨组织中OPG、RANKL和滑膜组织中MIF表达的影响与正常对照组(0.07±0.03)相比,模型组(0.19±0.07)、TG组(0.15±0.07)、GS组(0.16±0.05)、TG+GS组(0.13±0.06)关节骨组织中OPG表达差异有统计学意义(P<0.05),MTX组(0.11±0.07)、GS+MTX组(0.12±0.06)差异无统计学意义(P>0.05)。MTX组OPG表达最少,但TG+GS组与MTX组差异无统计学意义(P>0.05)。与正常对照组(0.08±0.03)相比,模型组(0.28±0.08)、TG组(0.19±0.10)、GS组(0.21±0.07)踝关节骨组织中RANKL表达差异有统计学意义(P<0.05),MTX组(0.13±0.08)、GS+MTX组(0.14±0.08)、TG+GS组(0.15±0.07)差异无统计学意义(P>0.05)。与正常对照组(0.07±0.03)相比,模型组(0.30±0.06)、MTX组(0.21±0.07)、TG组(0.25±0.10)、GS组(0.22±0.08)、GS+MTX组(0.19±0.08)、TG+GS组(0.21±0.08)滑膜组织中MIF表达差异有统计学意义(P<0.01);与模型组相比,MTX组、GS+MTX组、TG+GS组差异有统计学意义(P<0.05),TG组和GS组差异无统计学意义(P>0.05);MTX组、GS+MTX组和TG+GS组滑膜组织中MIF表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1血清MIF水平与TNF-α、IL-1β、RANKL、关节炎病理积分水平存在正相关关系,MIF上调TNF-α、IL-1β、RANKL的水平及加重骨破坏的病理变化,可能是其参与类风湿关节炎骨破坏的重要机制。2雷公藤多苷联合人参皂苷可能通过降低血清TNF-α、IL-1β、MIF、RANKL、OPG的水平和RANKL/OPG的比值,减少滑膜组织中MIF及关节骨组织中OPG、RANKL的表达,而对AA大鼠具有骨保护作用。3雷公藤多苷联合人参皂苷在拮抗MIF和降低RANKL/OPG比值方面的作用,进一步证实了它们在抗炎、骨保护方面的调控作用,从而为RA的治疗提供了新思路、新方法。

全文目录


中文摘要  4-9
英文摘要  9-16
研究论文 雷公藤多苷联合人参皂苷对佐剂性关节炎大鼠的骨保护作用及机制探讨  16-55
  前言  16-17
  材料与方法  17-23
  结果  23-28
  附图  28-39
  附表  39-44
  讨论  44-50
  结论  50
  参考文献  50-55
综述 细胞因子在类风湿关节炎关节破坏中的作用  55-65
致谢  65-66
个人简历  66

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