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护肝清脂片治疗非酒精性脂肪肝病的药效学研究及机制探讨

作　者: 唐外姣
导　师: 周本杰
学　校: 南方医科大学
专　业: 药剂学
关键词: 非酒精性脂肪肝护肝清脂片脂质蓄积胰岛素抵抗氧化应激/脂质过氧化损伤沉默信息调节因子1
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景护肝清脂片为原第一军医大学名老中医臧堃堂教授的经验方,由泽泻、山楂、三七、蒲黄、荷叶以及陈皮六味中药组成,经多年的临床验证,其具有良好的改善患者高血脂、胰岛素抵抗作用,可作为治疗非酒精性脂肪肝NAFLD (non-alcoholic fatty liver disease)疾病的良方。NAFLD的发病机制网络信号非常复杂,而沉默信息因子SIRT1经研究报道在NAFLD中起着极其重要的作用。沉默信息因子SIRT1属于Sirtuin家族,最初定义为NAD+依赖的去乙酰化酶家族,可使多种蛋白质的赖氨酸残基发生去乙酰化,Sirtuin是一类进化上高度保守的蛋白质,参与了细胞内多种生物学事件的发生,尤其是在细胞生存、寿命和物质代谢中具有重要作用。大量证据显示,NAFLD患者常常伴随着肥胖、脂代谢紊乱和胰岛素抵抗等代谢紊乱特征,美国临床内分泌一时学会提出的代谢综合征(MS)中已经将NAFLD作为MS的主要条件,而SIRT1在体内的表达和活性受NAD+/NADH比率的调节,而体内的NAD+/NADH比率反映了机体或细胞的物质能量代谢状态。在某种程度上,SIRT1可能起着一种营养感受器样的作用,通过细胞内NAD+水平波动来感知细胞内物质能量代谢状态,其可能在调节物质代谢、体内能量和营养内环境稳定方面发挥重要作用,而肝脏是机体调节物质代谢、能量和营养内环境稳定、调控血糖的重要器官,NAFLD是在肝脏发生的最为常见的疾病,NAFLD的发生是否也与能感知细胞能量状态的SIRT1相关,是一个十分值得关注的问题,护肝清脂片在改善NAFLD疾病的同时是否也促进了机体内肝脏组织中SIRT1的表达,这对探讨护肝清片防治NAFLD的作用机理具有重要的意义。NAFLD是指除酒精外和其他明确的损肝因素所致的,以弥漫性肝细胞大泡性脂肪病变为主要特征的临床病理综合征,包括单纯性脂肪肝以及由其演变的脂肪性肝炎和肝硬化。流行病学研究显示NAFLD可以影响任何年龄和任何种族的人群,在不同的国家当中大致有14%～24%的人患有NANLD,肥胖人群中高达57.5%～74%,现今NAFLD已成为仅次于乙肝的影响人类健康的第二类慢性肝脏疾病。NAFLD发病与胰岛素抵抗和遗传易感性有关。营养过剩所致体重增长过快和体重过重,肥胖、糖尿病、高脂血症等代谢综合征相关脂肪肝,以及隐源性脂肪肝均属于NAFLD发病原因。而SIRT1作为体内重要的去乙酰化酶,在调节机体物质代谢、体内能量和营养内环境稳定方面发挥重要作用。陈璐璐指出能量限制(CR,calorie restriction)可以促进高脂饮食建立的NAFLD大鼠模型体内的SIRT1的表达,具有改善NAFLD的作用。而白藜芦醇作为SIRT1的激动剂,具有改善NAFLD大鼠的胰岛素抵抗、调节肝脂等作用。种种迹象都表明SIRT1在NAFLD的发病机制中起着重要的作用。护肝清脂片由泽泻、山楂、三七、蒲黄、荷叶及陈皮六味中药组成。经多年临床实践表明：护肝清脂片在改善NAFLD患者血生化指标、恢复正常体重以及脂肪肝等方面具有确切的疗效,深受患者欢迎。但护肝清脂片防治NAFLD的药效及可能的作用机制如何我们知之甚少,限制了其推广应用,因此,系统研究其对NAFLD模型大鼠的药效作用并深入阐明其分子作用机理,明确其作用靶点,具有重要的现实意义和科学意义。目的本实验采用高脂饮食建立大鼠NAFLD模型,旨在研究护肝清脂片对于NAFLD的具体药效作用,同时对其作用机理进行初步探讨,以期为进一步开展护肝清脂片治疗NAFLD的基础研究以及临床应用提供科学依据。方法将60只体重180-220g♂SD大鼠按体重随机分为空白组(1ml/kg蒸馏水)、模型组(1ml/kg蒸馏水)、非诺贝特组(0.1g/kg)、护肝清脂片高(2.16g/kg)、中(1.08g/kg)、低剂量组(0.54g/kg),每组10只。空白组给予普通饲料,其它各组采用高脂饲料造模,同时给予各组大鼠相应的药物,连续12周。12周实验结束后,对所有大鼠进行腹主动脉采血并处死,测定肝脏相关的生化指标、血脂、肝指数、血糖、肝脏抗氧化能力、胰岛素抵抗指标等,取各组大鼠肝组织置于10%福尔马林中固定,常规石蜡连续切片及冰冻切片,HE染色以及油红O染色,用于观察各组大鼠肝脏的组织形态学病变情况。同时,采用RT-PCR及west-blotting方法检测沉默信息调节因子(SIRT1)在各组大鼠肝脏体内的表达情况。结果高脂饲料喂养12周后成功复制大鼠NAFLD模型,与空白组比较,模型组在肝脏保护作用、肝脂代谢、氧化应激/脂质过氧化损伤、胰岛素抵抗等方面都具有统计学显著性差异。而护肝清脂片的中、高剂量组对于NAFLD模型大鼠具有一定的防治作用,能延缓NAFLD疾病的发生。护肝清脂片能抑制转氨酶升高以及肝脏肿大,对于高脂饮食造成的肝脏损伤有一定的保护作用；生化学指标显示,护肝清脂片能明显抑制病变大鼠血脂代谢紊乱以及防止肝脏脂质蓄积,抑制空腹血糖及空腹胰岛素水平的升高,增加胰岛素敏感指数,降低胰岛素抵抗指数,延缓胰岛素抵抗；护肝清脂片能降低血液中脂质过氧化产物MDA的含量,提高血液中抗氧化酶SOD活力,对于氧化应激/脂质过氧化损伤也具有一定的保护作用；形态学指标显示,护肝清脂片能减轻NAFLD模型大鼠肝脏脂肪性病变、炎症坏死；RT-PCR和West blotting实验结果表明：与空白组相比,模型组SIRT1mRNA及蛋白表达显著性降低(P<0.05),而护肝清脂片中、高剂量组能显著上调肝脏中SIRT1mRNA和蛋白的表达(p<0.05,p<0.01)。结论护肝清脂片能够显著改善胰岛素抵抗,同时减缓氧化应激/脂质过氧化损伤,抑制肝脏胶原沉积,有效调节血脂代谢紊乱以及抑制肝脏脂质沉积,从不同环节及不同程度干预了大鼠NAFLD的发生与发展,从而对NAFLD模型大鼠表现出良好的防治药效。上调NAFLD模型大鼠肝脏中沉默信息因子SIRT1的mRNA及其蛋白的表达可能是护肝清片防治FNALD的机制之一。

全文目录

摘要  3-7
ABSTRACT  7-13
前言  13-18
第一章文献综述  18-24
  1 NASH的发病原因与机制  18-20
  2 NASH的常用治疗方法  20-21
  3 SIRT1与NASH  21-23
  4 讨论  23-24
第二章护肝清脂片防治NAFLD模型大鼠的药效学研究  24-48
  引言  24
  1 实验材料  24-26
  2 实验方法  26-30
  3 实验结果  30-44
  4 讨论  44-47
  5 小结  47-48
第三章护肝清脂片对NAFLD模型大鼠SIRT1表达的影响  48-63
  引言  48
  1 实验材料  48-50
  2 实验方法  50-57
  3 实验结果  57-59
  4 讨论  59-62
  5 小结  62-63
全文总结  63-65
参考文献  65-72
英文缩略语表  72-74
研究生期间所发表的文章  74-75
致谢  75-76

护肝清脂片治疗非酒精性脂肪肝病的药效学研究及机制探讨

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