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四川省松潘三种秦艽的质量评价研究

作　者: 张明燕
导　师: 方成武
学　校:
专　业: 生药学
关键词: 秦艽四川松潘质量评价电化学指纹图谱 DNA条形码 UPLC
分类号: R282
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：对四川松潘地产3种秦艽进行质量评价，并建立秦艽质量评价的定性、定量方法，为该地秦艽的进一步发展提供参考。方法:1．应用植物形态、药材性状、药材粉末显微特征、药材粉末B-Z震荡图谱和DNA条形码方法对四川松潘地产三种秦艽进行定性鉴别研究。2．采用超高效液相色谱法，对四川省松潘地产3种秦艽药材中马钱苷酸和龙胆苦苷含量进行测定，并考察海拔高度对其含量的影响；采用原子吸收和气相色谱法，对不同产地和不同品种的秦艽药材及对应土壤中重金属和农药残留进行测定,从而对秦艽进行定量质量评价研究。结果：1．三种秦艽在植物形态特征、药材性状、药材粉末显微特征等方面均有一定的差异。其中大叶秦艽花冠檐蓝色或紫蓝色，药材根中部以下多不分枝形如“鸡腿”或“萝卜”，药材粉末显微结构中无厚壁网纹细胞和纤维。粗茎秦艽花冠冠檐蓝色或深紫色，药材根中部多不分枝，少相互扭绕，根头顶端有较大茎基，中心有较大的凹窝，药材粉末显微结构中无厚壁网纹细胞和纤维，导管多具螺纹及网纹加厚。麻花秦艽的花冠黄绿色，多数药材中部以下相互分离后纠聚连成一体形如“麻花”或“发辫”，药材粉末显微结构中具有厚壁网纹细胞和纤维。首次建立了电化学和DNA拼接条形码在秦艽药材中的鉴别方法。三种秦艽药材粉末的电化学指纹图谱具有各自的特征，粗茎秦艽的诱导期最长，大叶秦艽次之，其次是麻花秦艽。震荡寿命按由长到短的顺序依次为麻花秦艽>大叶秦艽>粗茎秦艽。对23个样本DNA提取、PCR及双链测序成功率分别为ITS(74%)、psbA-trnH(83%)、rbcL(91%)。大叶秦艽、粗茎秦艽、麻花秦艽3个品种ITS、psbA-trnH、rbcL序列长度分别为624~628bp、315~398bp、702~703bp。将叶绿体的psbA-trnH和rbcL序列拼接，ITS、psbA-trnH和rbcL序列拼接，组合而成的DNA条形码NJ系统发育树可以直观的表现出秦艽的原植物间的亲缘关系及系统发育，psbA-trnH+rbcL的种间遗传距离(0.004～0.025)大于种内遗传距离(0～0.001、0、0)，ITS+psbA-trnH+rbcL的种间遗传距离(0.006～0.02)也大于种内遗传距离(0～0.001、0.002、0)，两者均可用于秦艽的分子鉴定。2．建立以马钱苷酸和龙胆苦苷为定量指标性成分的秦艽药材质量评价体系。采用UPLC法同时测定不同品种秦艽药材中马钱苷酸和龙胆苦苷的含量，色谱条件：BEH C18(2.1mm×50mm，1.7μm)色谱柱，乙腈-0.1%醋酸溶液为流动相；流速为0.35ml/min，检测波长为254nm；色谱峰峰形较好，基线稳定，理论塔板数、分离度、拖尾因子均符合规定。马钱苷酸和龙胆苦苷浓度分别在9.9～157.8μg/ml和15.8～252.5μg/ml范围内，与峰面积成良好的线性关系(r＞0.9998)；平均加样回收率分别为101.23%、99.78%，RSD分别为1.69、1.94。四川松潘地区秦艽药材与土壤中的铅含量均符合规定，铜的含量也基本符合要求，药材中的砷也符合规定。少数药材样品中镉和汞含量超标，土壤中镉、汞和砷含量有部分超标，在检测限度下秦艽药材与其生长土壤中均未检测出有机氯农药残留。结论：1．植物形态特征、药材性状、药材粉末显微特征、电化学以及DNA条形码均可用于秦艽的定性鉴别。其中电化学指纹图谱具有很好的特征性和专属性，在严格控制实验条件和实验操作的条件下，获得的电化学指纹图谱具有良好的重现性。不同品种的秦艽药材由于所含化学成分及各成分相对含量不同，所得到的电化学指纹图谱具有各自的特征。该法与经典的色谱法相比，不仅对药材的需求量更少，不需要复杂的前处理，分析成本更低，操作简单，而且灵敏、直观、重现性好，适用于绝大多数成分复杂中药材及中药制剂的鉴别与评价。根类药材DNA难以提取，这可能是由于根类药材不易裂解，并且根类药材中含有多糖、多酚或者一些次生代谢产物会干扰DNA的提取，改进的DNA提取方法能更高效的从药材中提取DNA；叶绿体的psbA-trnH和rbcL序列拼接，ITS、psbA-trnH和rbcL序列拼接，组合而成的DNA条形码NJ系统发育树可以直观的表现出秦艽的原植物间的亲缘关系及系统发育，计算遗传距离可以量化这些特征，在技术逐渐发展成熟的基础上，根据DNA barcoding鉴定技术可以设计生产“便携式中药鉴定分析扫描仪”，鉴定人员即使不具有很高的专业知识和技术能力也可以完成物种鉴定工作，克服了药材无法准确鉴定物种这一难题。2．从定量角度对四川省松潘地区产3种秦艽进行质量评价：超高效液相色谱法测定该地秦艽药材中马钱苷酸和龙胆苦苷的含量符合《中华人民共和国药典》质量标准，且含量远远高于药典要求，其中大叶秦艽和粗茎秦艽指标性成分含量与海拔高度呈高度的相关性；所建立的质量控制方法快捷、准确、灵敏度高、重复性好，可用于秦艽药材的质量控制。从安全性这一角度对松潘地区秦艽药材进行质量评价，总体来看，该地秦艽药材质量优良，安全性较高。但是初露头角的重金属超标问题也不容忽视，保护该地的生态环境，为该地秦艽的保护和进一步发展营造良好的生态环境刻不容缓。

全文目录

中文摘要  6-9
Abstract  9-14
第一章前言  14-16
第二章四川省松潘地区三种秦艽的定性鉴别  16-46
  1 原植物鉴别与性状鉴别  16-22
    1.1 样品的采集与收集  16-18
    1.2 原植物鉴别  18-20
    1.3 性状鉴别  20-22
  2 显微鉴别  22-26
    2.1 实验仪器与试药  22
    2.2 实验方法  22-23
    2.3 实验结果  23-25
    2.4 结果分析  25-26
    2.5 结论与讨论  26
  3 电化学鉴别  26-31
    3.1 实验仪器与试药  26-27
    3.2 方法与结果  27-30
    3.3 结论与讨论  30-31
  4 DNA 条形码鉴别  31-46
    4.1 实验仪器与试药  31-33
    4.2 实验方法  33-36
    4.3 结果分析  36-44
    4.4 结论与讨论  44-46
第三章四川省松潘地区秦艽的定量研究  46-90
  1 四川省松潘地产秦艽指标性成分的含量测定  46-54
    1.1 实验仪器与试药  46
    1.2 实验方法  46-51
    1.3 含量测定  51-52
    1.4 结果分析  52-53
    1.5 结论与讨论  53-54
  2 四川省松潘地区秦艽的安全性评价研究  54-90
    2.1 有害金属的含量检测  54-79
    2.2 有机氯农药残留检测  79-88
    2.3 结论与讨论  88-90
第四章结语  90-95
参考文献  95-100
综述  100-119
  参考文献  113-119
个人简历  119-120
攻读硕士学位期间发表的论文  120-121
致谢  121-122

四川省松潘三种秦艽的质量评价研究

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