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组织蛋白酶L的高效表达

作　者: 鄢荣歆
导　师: 丛丽娜
学　校: 大连工业大学
专　业: 发酵工程
关键词: 海参组织蛋白酶L 重组表达活性鉴定
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

海参是一种非常重要的水产经济动物，具有很高的营养和药用价值，海参的养殖及相关功能食品的开发日益受到关注。多种理化因素造成的海参自溶是新鲜海参保存、运输与加工过程中难以克服的主要问题。已研究证明，存在于海参体壁与肠中的一系列内源性组织蛋白酶是海参自溶的主导因素。因此，研究海参组织蛋白酶是调控和利用其自溶过程的重要前提。组织蛋白酶L是一种嗜酸性溶酶体蛋白水解酶，广泛存在于人体各种正常组织细胞和肿瘤细胞中，它不仅参与生物体内各种蛋白水解，还参与许多重要的生命活动，如抗原呈递、肿瘤入侵和转移、骨质吸收、细胞凋亡等。本实验从海刺参(Stichopus japonicus)肠中克隆得到编码组织蛋白酶L (SjCL)基因(GenBank accession number: EU143709)，开放阅读框(ORF)999bp，编码332个氨基酸(aa)，包括组织蛋白酶L成熟肽316aa和信号肽16aa，分子量预测为35.3kDa。用SjCL序列与相似物种海胆、海葵等进行对比，可知SjCL具有组织蛋白酶L所特有的氨基酸保守区域ERFNIN和GNFD，以及由Cys139，His278和Asn299残基组成的保守活性位点。将编码SjCL基因克隆进原核表达载体pET32a(+)中，构建重组质粒pET32a(+)-SjCL，转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞，再进行诱导表达、亲和纯化和透析复性，得到了具有活性的重组SjCL。酶活力检测结果表明，重组SjCL对组织蛋白酶L特异性底物Z-Phe-Arg-Nmec具有较高活性，而对组织蛋白酶B特异性底物Z-Arg-Arg-Nmec无活性。本实验对SjCL的cDNA序列进行了生物信息学分析并通过基因工程的手段表达出具有活性的重组SjCL，为进一步研究组织蛋白酶L在海刺参自溶过程中的作用提供理论基础。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-11
第一章文献综述  11-24
  1.1 海参概述  11-12
  1.2 海参的自溶  12
  1.3 蛋白酶和组织蛋白酶  12-15
    1.3.1 蛋白酶  12
    1.3.2 组织蛋白酶  12-15
      1.3.2.1 组织蛋白酶的简介  12-13
      1.3.2.2 组织蛋白酶的结构  13-14
      1.3.2.3 组织蛋白酶 L 的鉴定  14
      1.3.2.4 组织蛋白酶 L 研究进展及意义  14-15
  1.4 PCR 扩增  15-16
  1.5 DNA 酶切  16
  1.6 凝胶电泳  16-18
    1.6.1 琼脂糖电泳  16-17
    1.6.2 SDS-PAGE  17-18
  1.7 外源基因的原核表达  18-23
    1.7.1 原核表达系统  18
    1.7.2 原核表达载体  18-20
    1.7.3 原核表达菌株  20
    1.7.4 原核表达中包涵体的形成  20-21
    1.7.5 减少包涵体形成的方法  21
    1.7.6 包涵体的复性  21-23
  1.8 本课题的主要研究思路和内容  23-24
第二章材料与方法  24-45
  2.1 实验材料  24-29
    2.1.1 实验原料  24
    2.1.2 主要实验仪器  24-25
    2.1.3 主要实验试剂  25-26
    2.1.4 主要溶液的配置  26-29
      2.1.4.1 培养基  26-27
      2.1.4.2 电泳用溶液  27-28
      2.1.4.3 亲和层析柱用液  28
      2.1.4.4 酶活性检测反应溶液  28
      2.1.4.5 其他溶液  28-29
  2.2 实验方法  29-45
    2.2.1 海刺参肠 RNA 的提取  29-31
      2.2.1.1 材料的准备  29
      2.2.1.2 海刺参肠 RNA 的提取  29-31
    2.2.2 组织蛋白酶 L 序列分析  31
    2.2.3 基因克隆的 PCR 引物设计与合成  31
    2.2.4 SjCL 基因的 RT-PCR 扩增和产物的回收纯化  31-33
      2.2.4.1 SjCL 基因的 RT-PCR 扩增  31-32
      2.2.4.2 RT-PCR 扩增产物的检测  32
      2.2.4.3 RT-PCR 扩增产物的回收纯化  32-33
    2.2.5 重组质粒的构建、转化及阳性克隆的筛选  33-35
      2.2.5.1 重组质粒 pMD18-T-SjCL 的构建  33
      2.2.5.2 重组质粒 pMD18-T-SjCL 的转化及重组质粒的阳性克隆筛选  33-35
    2.2.6 重组质粒 pMD18-T-SjCL 的提取  35-36
    2.2.7 重组质粒 pMD18-T-SjCL 的酶切  36
    2.2.8 组织蛋白酶 L 基因在大肠杆菌中的表达  36-38
      2.2.8.1 pET32a(+)-SjCL 重组质粒的构建  36
      2.2.8.2 扩大培养  36-37
      2.2.8.3 菌种的诱导及表达  37
      2.2.8.4 菌体的破碎  37-38
    2.2.9 SDS-PAGE  38-39
      2.2.9.1 胶板的制备  38
      2.2.9.2 样品的处理  38-39
      2.2.9.3 加样方法  39
      2.2.9.4 电泳  39
      2.2.9.5 染色  39
      2.2.9.6 脱色  39
      2.2.9.7 蛋白大小的确定  39
    2.2.10 包涵体的处理  39-41
      2.2.10.1 包涵体的收集  40
      2.2.10.2 包涵体的洗涤，变性  40-41
    2.2.11 纯化  41-43
      2.2.11.1 纯化及复性  41-42
      2.2.11.2 Lowry 法测定蛋白质含量  42-43
    2.2.12 SjCL 活性鉴定  43-45
      2.2.12.1 紫外光谱法确定底物标准品 NMec 的最大吸光度值  43
      2.2.12.2 荧光光谱法确定 NMec 最大荧光强度值  43
      2.2.12.3 NMec 标准曲线的绘制  43
      2.2.12.4 酶活力的测定  43-44
      2.2.12.5 SjCL 底物特异性的研究  44-45
第三章实验结果和讨论  45-61
  3.1 海参肠总 RNA 的质量分析  45
  3.2 海刺参组织蛋白酶 L 序列分析  45-48
    3.2.1 海刺参组织蛋白酶 L 序列分析  45-47
    3.2.2 海刺参组织蛋白酶 L 序列系统进化树分析  47-48
  3.3 RT-PCR 反应扩增 SjCL 基因  48-49
  3.4 pMD18-T-SjCL 重组子构建及酶切鉴定  49-51
    3.4.1 pMD18-T-SjCL 重组质粒的构建  49-50
    3.4.2 pMD18-T-SjCL 重组质粒的酶切鉴定  50-51
  3.5 pET32a(+)-SjCL 重组子及酶切鉴定  51-52
    3.5.1 pET32a(+)-SjCL 重组质粒的构建  51
    3.5.2 pET32a(+)-SjCL 重组质粒酶切鉴定  51-52
  3.6 重组 SjCL 基因工程菌在大肠杆菌中表达条件的确定  52-53
  3.7 包涵体超声破碎条件的确定  53-55
    3.7.1 菌体破碎方法的确定  53-54
    3.7.2 超声波破碎方法的优化  54
    3.7.3 表达产物形式的确定  54-55
  3.8 重组 SjCL 蛋白的含量测定  55-57
    3.8.1 亲和层析纯化  55-56
    3.8.2 目的蛋白的含量测定  56-57
  3.9 重组 SjCL 酶活性鉴定  57-61
    3.9.1 紫外光谱法确定底物标准品 NMec 的最大吸光度值  57-58
    3.9.2 荧光光谱法确定 NMec 最大荧光强度值  58-59
    3.9.3 NMec 标准曲线  59
    3.9.4 酶活力的测定及底物特异性鉴定  59-61
第四章结论  61-62
参考文献  62-65
致谢  65

组织蛋白酶L的高效表达

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