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海参虫草复剂对糖尿病大鼠肾脏保护作用及其机制的研究
作 者: 李晓林
导 师: 高昕
学 校: 中国海洋大学
专 业: 水产品加工及贮藏工程
关键词: 海参 蛹虫草 糖尿病肾病 尿微量白蛋白 抗氧化 转化生长因子-β_l 结缔组织生长因子
分类号: R285.5
类 型: 硕士论文
年 份: 2010年
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内容摘要
糖尿病肾病(Diabetes nephropathy, DN)是常见的糖尿病慢性微血管并发症,病人晚期出现严重肾功能衰竭,是导致糖尿病患者死亡的主要原因之一。因此,控制和延缓糖尿病肾病的发生和发展过程具有重要的临床意义。海参自古以来被视为珍贵的滋补品,其味咸性温补,具有补肾益精、养血润燥、滋阴壮阳之功效。海参中含有海参多糖、海参皂苷、胶原多肽、脑苷脂等多种活性物质,具有抗氧化、降血脂、降血压和免疫调节等生理活性。蛹虫草又名北冬虫夏草,其化学成分与冬虫夏草相似,富含虫草多糖、虫草素、虫草酸、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)等活性物质,具有降血糖、抗肿瘤、调节免疫和抗衰老等功能。中医认为其味甘性温平,具有补肺益肾、化痰止咳等功能。将二者配药具有大补元气、补肾益肺、养血生精之功效。本研究采用一次性腹腔注射STZ的方法建立糖尿病大鼠模型,在长期高血糖环境下造成肾脏损伤。采用日本刺参(Apostichopus japonicus)和蛹虫草(Cordyceps militaris)配制成的复剂灌胃STZ诱导的糖尿病模型大鼠,研究其对大鼠肾脏的保护作用,并对其作用机理进行了较系统和深入的研究。实验同时设立了海参和虫草单剂组作为比较。主要研究结果如下:海参虫草复剂具有显著的降血糖和提高肾小球率过功能的作用。实验结果显示:海参虫草复剂能显著降低糖尿病大鼠空腹血糖和肾肥大指数(P<0.05,P<0.01),显著降低血清中尿素氮(Blood urea nitrogen, BUN)、肌酐(Creatinine, Cr)和尿酸(Uric acid, UA)的含量(P<0.05,P<0.01),显著减少尿蛋白、微量白蛋白(Microalbuminuria, mAlb)及N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-Glucosaminidase, NAG)的排泄率(P<0.05,P<0.01)。且海参虫草复剂的效果优于单剂。海参虫草复剂具有显著的脂质代谢调节作用。结果表明:海参虫草复剂能显著降低糖尿病大鼠血清中总胆固醇(Total cholesterol, TC)、甘油三酯(Triglyceride, TG)和游离脂肪酸(Free fatty acid, FFA)的含量(P<0.05,P<0.01),提高肝脏中饱和脂肪酸(Saturated fatty acid, SFA)比例、降低单不饱和脂肪酸(Mono-unsaturated fatty acid, MUFA)比例,并显著降低肝脏中硬脂酰辅酶A去饱和酶(Stearoyl-CoA desaturase, SCD)活性。提示海参虫草复剂对脂质代谢的调节作用可能是通过降低SCD活性来抑制脂质合成实现的。海参虫草复剂具有显著的抗氧化功能。实验结果显示,海参虫草复剂能显著降低糖尿病大鼠肾脏中丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、一氧化氮(Nobelium, NO)含量(P<0.01),提高肾脏中SOD和过氧化氢酶(Catalase, CAT)活力(P<0.05,P<0.01)。提示海参虫草复剂可通过提高肾脏抗氧化酶活性,清除体内自由基,从而达到肾脏保护作用。海参虫草复剂效果较海参和虫草单剂使用时优。采用光学显微镜及透射电镜观察,研究了海参虫草复剂对糖尿病大鼠肾脏组织显微和亚显微结构的影响。显微观察结果表明:海参虫草复剂能显著抑制糖尿病大鼠肾小球和肾小管肿大、系膜区扩大和系膜细胞增生。亚显微观察结果显示,海参虫草复剂能显著抑制糖尿病大鼠基底膜节段性增厚,减轻足突细胞融合现象,减少溶酶体在系膜区的聚集。说明海参虫草复剂能显著改善糖尿病大鼠肾脏组织的病理学改变,且海参虫草复剂效果优于单剂。利用RT-PCR、Western blot和免疫组化等方法研究了海参虫草复剂对糖尿病大鼠肾脏保护的机制。结果表明,海参虫草复剂能显著抑制糖尿病大鼠肾脏中转化生长因子-β1(Transforming growth factor beta, TGF-β1)及其Ⅱ型受体(TypeⅡreceptor of TGF-β, TβRⅡ)、结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor, CTGF)的mRNA表达,降低肾脏中TGF-β1及Ⅳ胶原蛋白的表达,提高过氧化物酶体增殖激活受体γ(Peroxisome proliferator activated receptor-γ, PPARγ)的基因表达。TGF-β1与TβRⅡ结合后发挥其生物活性直接造成肾脏损伤,并介导其下游因子CTGF的表达,促进Ⅳ胶原等细胞外基质合成、抑制其降解,导致肾脏肥大。而PPARγ激活可调节体内脂质代谢,减少脂质过氧化物对TGF-β1的刺激。提示海参虫草复剂可通过提高体内PPARγ活性,改善体内脂肪代谢紊乱,并抑制TGF-β1、TβRⅡ和CTGF的表达,从而减少细胞外基质合成,达到保护肾脏的作用。且海参虫草复剂的效果优于海参和虫草单剂使用的效果。本论文首次全面系统地研究了海参虫草复剂对糖尿病大鼠肾脏的保护作用,并对其机制进行了深入探讨。进一步挖掘了海参和虫草的药用价值,为海参虫草复剂临床推广应用于预防和治疗糖尿病肾病提供了较为全面、深入的分子水平的理论依据。
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全文目录
摘要 7-10 Abstract 10-17 前言 17-36 1 糖尿病肾病 17 2 糖尿病肾病的主要发病机制 17-26 2.1 高血糖 17-19 2.2 氧化应激 19-20 2.3 脂质代谢紊乱 20 2.4 细胞因子 20-26 2.4.1 转化生长因子-β(TGF-β) 21-23 2.4.2 结缔组织生长因子(CTGF) 23-24 2.4.3 过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ) 24-25 2.4.4 一氧化氮(NO) 25-26 3 海参活性成分及其生理功效 26-31 3.1 海参皂苷 26-28 3.2 海参多糖 28-30 3.3 海参胶原蛋白和胶原肽 30-31 3.4 海参脑苷脂 31 4 蛹虫草活性成分及其生理功效 31-35 4.1 虫草多糖 32-33 4.2 虫草素 33-34 4.3 虫草酸 34 4.4 SOD 34-35 5 立题依据及研究的目的和意义 35-36 第一章 海参虫草复剂对糖尿病大鼠肾脏早期病变的影响 36-59 第一节 对糖尿病大鼠肾脏功能的影响 36-46 1 材料与方法 36-40 1.1 材料 36-38 1.1.1 海参虫草复剂 36 1.1.2 实验动物 36-37 1.1.3 药品及试剂 37 1.1.4 主要使用仪器 37 1.1.5 主要试剂的配制 37-38 1.2 实验方法 38-40 1.2.1 动物分组及模型建立 38 1.2.2 标本收集及处理 38-39 1.2.3 血糖的测定 39 1.2.4 肾肥大指数测定 39 1.2.5 血清尿素氮、肌酐和尿酸含量测定 39 1.2.6 尿中总蛋白、微量白蛋白含量测定 39-40 1.2.7 尿Cr含量测定 40 1.2.8 尿液中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)含量测定 40 1.3 统计学分析 40 2 结果 40-46 2.1 一般状况观察 40-41 2.2 对空腹血糖的影响 41 2.3 对肾脏指数的影响 41-42 2.4 对血清BUN、Cr和UA含量的影响 42-43 2.5 对排尿量、尿总蛋白和mAlb排泄率的影响 43 2.6 对内生肌酐清除率的影响 43-44 2.7 对尿NAG排泄率的影响 44-46 第二节 对糖尿病大鼠脂质代谢的影响 46-52 1 材料与方法 46-49 1.1 材料 46-47 1.1.1 样品制备 46 1.1.2 实验动物 46 1.1.3 药品及试剂 46-47 1.1.4 主要使用仪器 47 1.1.5 主要试剂的配制 47 1.2 实验方法 47-48 1.2.1 动物分组及实验 47 1.2.2 血清脂质含量测定 47 1.2.3 血清游离脂肪酸含量测定 47-48 1.2.4 肝脏中脂肪酸组成测定 48 1.3 统计学处理 48-49 2 结果 49-52 2.1 对大鼠血清脂质水平的影响 49 2.2 对大鼠血清FFA含量的影响 49-50 2.3 对大鼠肝脏中脂肪酸组成的影响 50-52 第三节 对糖尿病大鼠肾脏抗氧化能力的影响 52-58 1 实验材料与方法 52-54 1.1 材料 52-53 1.1.1 样品制备 52 1.1.2 实验动物 52 1.1.3 药品及试剂 52 1.1.4 主要使用仪器 52-53 1.2 实验方法 53 1.2.1 动物分组及实验 53 1.2.2 肾脏匀浆的制备 53 1.2.3 肾脏中MDA含量测定 53 1.2.4 肾脏中SOD活力测定 53 1.2.5 肾脏中CAT活力测定 53 1.2.6 肾脏中GSH-PX活力测定 53 1.2.7 肾脏中NO含量测定 53 1.3 统计学处理 53-54 2 结果 54-56 2.1 对大鼠肾脏中MDA含量的影响 54 2.2 对大鼠肾脏中SOD活力的影响 54 2.3 对大鼠肾脏中CAT活力的影响 54 2.4 对大鼠肾脏中GSH-PX活力的影响 54-55 2.5 对大鼠肾脏中NO含量的影响 55-56 3 讨论 56-58 本章小结 58-59 第二章 海参虫草复剂对糖尿病大鼠肾脏组织形态学的影响 59-69 1 实验材料与方法 59-62 1.1 材料 59-61 1.1.1 样品制备 59 1.1.2 实验动物 59 1.1.3 药品及试剂 59 1.1.4 主要使用仪器 59-60 1.1.5 主要试剂配制 60-61 1.2 实验方法 61-62 1.2.1 动物分组及实验 61 1.2.2 光学显微镜观察 61-62 1.2.3 透射电镜观察 62 2 结果 62-66 2.1 肾脏显微结构观察结果 62-63 2.2 电镜观察结果 63-66 2.2.1 肾小球超微结构观察 63-65 2.2.2 肾小管超微结构观察 65-66 3 讨论 66-67 4 小结 67-69 第三章 海参虫草复剂对糖尿病大鼠肾脏保护作用机制的研究 69-86 1 材料与方法 69-76 1.1 材料 69-71 1.1.1 样品制备 69 1.1.2 实验动物 69 1.1.3 药品及试剂 69-70 1.1.4 主要使用仪器 70 1.1.5 主要试剂配制 70-71 1.2 实验方法 71-76 1.2.1 动物分组及实验 71 1.2.2 RT-PCR法检测肾脏中TGF-β1、TβRⅡ、CTGF和PPARγ mRNA表达 71-74 1.2.3 Western blot法检测肾脏中TGF-β1蛋白表达 74-76 1.2.4 免疫组化法检测肾脏中Ⅳ型胶原蛋白的表达 76 1.3 统计学分析 76 2 结果 76-82 2.1 对大鼠肾脏中TGF-β_1 mRNA及蛋白表达的影响 76-77 2.2 对大鼠肾脏中TβR Ⅱ mRNA表达的影响 77-78 2.3 对大鼠肾脏中CTGFmRNA表达的影响 78-79 2.4 对大鼠肾脏中PPARγmRNA表达的影响 79-80 2.5 对大鼠肾脏中Ⅳ型胶原蛋白表达的影响 80-82 3 讨论 82-84 4 小结 84-86 结论 86-87 本论文的特色及创新之处 87-88 参考文献 88-104 硕士期间发表论文情况 104-105 致谢 105-106 个人简历 106
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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学 > 中药实验药理
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