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高产油小球藻的诱变育种及其油脂提取研究

作　者: 刘宪夫
导　师: 王长海；孙利芹
学　校: 南京农业大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 小球藻生物量油脂含量油脂提取微藻诱变育种
分类号: S917.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

油脂是一类重要的资源,与植物油脂相似,微藻油脂可以用来生产生物柴油。近年来,从微藻中制备生物柴油的研究也引起了我国政府、科研机构和企业的重视,被列为科技部“973”和“863”计划的重点项目之一。有望成为“后石油时代”破解能源危机的一把金钥匙。目前对产油藻的研究主要有葡萄藻(Botryococcus braunii)、小球藻(Chlorella pyrenoidosa)等。以小球藻为原料生产的生物质燃油非常宜于柴油发动机的燃烧,且小球藻的高含油量和生长迅速的特征,被认为是最有工业化潜力的生物柴油的生产藻株之一。本研究从以下几个方面对小球藻进行了系统的研究：小球藻生物量、油脂含量快速测定方法的研究,小球藻的培养周期内生物量及油脂含量的变化,运用气相分析小球藻油脂不同提取方法的比较,通过对小球藻紫外、EMS复合浅蓝菌素等诱变育种筛选油脂含量高的小球藻藻种,旨在开发一种油脂含量高的微藻资源。主要结果如下：1.小球藻684nm的吸光值与细胞密度和干重存在理想线性关系,在423nm处的吸光值与不同含量的油脂反应物存在理想的线性关系。因此,只需测定藻液的OD值既能快速的换算出细胞密度、干重与油脂含量。2.确定了小球藻采收时间。当生长到稳定期时,小球藻的生物量积累到最大,此时细胞内的油脂积累也达到了最大；因此,对于提取油脂而言,培养10-11d为最佳的采收时间。3.本研究发现不同的取方法其油脂得率、油脂中中长链脂肪酸(C14—C22)占总脂肪酸比例及脂肪酸提取纯度各不相同。其中,氯仿-甲醇浸提法是一种简便快捷高效的油脂提取方法,其油脂得率为22.40±0.89%,中长链脂肪酸(C14—C22)比例为85.84%；索氏提取法中无水乙醇作为提取溶剂获得的得率最高为24.37±0.21%；而石油醚提取的油脂脂肪酸成分最多,达到10种。4.对三种诱变方法进行了比较研究,结果发现：在紫外诱变中,诱变藻株的正突变率为16.7%,得到的诱变藻株中,油脂含量最高的比原始株提高5.63%；在EMS诱变中,小球藻的正突变率为40%,诱变藻株中,油脂含量比原始藻株提高7.29%；在EMS复合浅蓝菌素诱变中,小球藻的正突变率达到了60%,油脂含量比原始藻株提高了9.03%。诱变藻株生物量积累方面,紫外及EMS诱变藻株生物量没有明显提高,EMS复合浅蓝菌素诱变中,诱变藻株的生物量有了小幅提高。三种诱变得到的诱变藻株都有良好的遗传稳定性。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
引言  11-13
第一章文献综述  13-27
  1.1 生物柴油概述  13-15
    1.1.1 引言  13
    1.1.2 生物柴油基本性质  13-14
    1.1.3 国内外制备生物柴油原料的研究进展  14-15
  1.2 微藻制备生物柴油  15-16
    1.2.1 国外微藻制备生物柴油发展状况  15-16
    1.2.2 我国微藻制备生物柴油的研究进展  16
    1.2.3 微藻制备生物柴油的优点  16
    1.2.4 制约微藻制备生物柴油生产的因素  16
  1.3 小球藻概述  16-19
    1.3.1 小球藻的主要成分  17
    1.3.2 小球藻的培养  17-18
    1.3.3 利用小球藻作生产生物柴油的可行性  18-19
  1.4 小球藻生物量的测定方法  19-20
  1.5 小球藻油脂含量测定及油脂提取方法  20-23
    1.5.1 有机溶剂提取法  20-21
    1.5.2 索氏提取法  21
    1.5.3 荧光染料测定法  21-22
    1.5.4 磷酸香草醛法  22
    1.5.5 CO_2超临界提取法  22-23
  1.6 微藻油脂成分的测定  23
  1.7 海洋微藻育种技术研究  23-25
    1.7.1 选择育种  23-24
    1.7.2 诱变育种  24
    1.7.3 细胞融合  24
    1.7.4 基因工程  24-25
  1.8 本研究的内容、目的与意义  25-27
第二章高产油小球藻的培养、生物量及油脂含量的快速测定  27-39
  2.1 材料与仪器  27
  2.2 实验方法  27-29
    2.2.1 小球藻的培养  27-28
    2.2.2 F/2培养基配置  28
    2.2.3 小球藻生物量与油脂含量快速测定  28-29
    2.2.4 小球藻生物量以及油脂含量的动态测定  29
  2.3 结果与讨论  29-36
    2.3.1 小球藻藻液可见光光吸收波长扫描及最适波长的验证  29-31
    2.3.2 光密度法与细胞计数法、干重法之间的关系  31-32
    2.3.3 小球藻油脂-磷酸香草醛反应物的光吸收波长扫描及最适波长的验证  32-33
    2.3.4 油脂含量标准曲线的建立  33-34
    2.3.5 小球藻生物量以及油脂含量的动态变化  34-36
  2.4 小结  36-39
第三章小球藻油脂不同提取方法的比较  39-49
  3.1 材料与方法  39-41
    3.1.1 材料、试剂与仪器  39-40
    3.1.2 试验方法  40-41
  3.2 结果与讨论  41-46
    3.2.1 油脂提取方法比较  41-43
    3.2.2 油脂脂肪酸组成分析  43-46
  3.3 小结  46-49
第四章小球藻诱变育种  49-65
  4.1 材料与仪器  49-50
  4.2 实验方法  50-52
    4.2.1 小球藻紫外诱变  50-51
    4.2.2小球藻的EMS诱变  51-52
    4.2.3 小球藻的EMS复合浅蓝菌素诱变  52
  4.3 结果与讨论  52-63
    4.3.1 小球藻紫外诱变  52-56
    4.3.2 小球藻的EMS诱变  56-59
    4.3.3 小球藻的EMS复合浅蓝菌素诱变  59-63
  4.4 小结  63-65
第五章总结与展望  65-67
  5.1 总结  65
  5.2 展望  65-67
创新点  67-69
参考文献  69-77
附录  77-79
致谢  79-81
攻读学位期间发表的学术论文目录  81

高产油小球藻的诱变育种及其油脂提取研究

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