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基于基因组信息的大黄鱼（Pseudosciaena crocea）微卫星标记开发及应用

作　者: 李红梅
导　师: 吕振明
学　校: 浙江海洋学院
专　业: 海洋生物学
关键词: 大黄鱼微卫星标记重复类型引物开发遗传变异
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

大黄鱼（Pseudosciaena crocea）属于鲈形目、石首鱼科，是我国主要的海洋经济鱼类之一。本研究拟在已开展的大黄鱼基因组测序基础上，对大黄鱼微卫星序列特征进行分析与统计；开展大黄鱼微卫星标记的快速筛选；然后利用已经成功开发的微卫星标记对大黄鱼现有群体遗传多样性和种群变异进行了研究，其主要研究成果如下：1.基于基因组信息的大黄鱼微卫星重复序列的特征分析通过对大黄鱼全基因组中的微卫星重复序列进行搜索，在长度为619Mb的大黄鱼基因组中，共找到68008个微卫星重复序列，其序列总长度约占全基因组序列的0.47%。共发现单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸及六核苷酸等6种微卫星类型，在微卫星序列中，二核苷酸重复的序列数目最多，约占微卫星序列总数的71.03%，四核苷酸重复类型排在第二位，占11.88%。而在二核苷酸重复类型中，以AC基序含量最多，占到了二碱基重复类型的90.18%。对不同重复类型微卫星的变异系数进行统计，三核苷酸重复微卫星具有最大的变异系数，0.88。对不同重复单元的重复次数的变化进行了分析，结果表明，重复单元的长度与拷贝数呈负相关关系（r=-0.534），随着组成微卫星序列的重复单元长度的增加，相应微卫星的拷贝数在减少。本研究对不同重复单元中的AT含量进行了统计，发现其含量与重复单元的不同重复单元微卫星的序列总数、累积长度以及平均拷贝数之间的呈正相关关系，AT含量的增加，这三者的数据就会相应的增加。2.基于全基因组信息的大黄鱼微卫星标记引物的快速筛选及评价本研究利用基因组信息的方法开发大黄鱼微卫星标记。开发的微卫星标记直接来自大黄鱼全基因组序列，通过在完整的微卫星序列侧翼设计引物，进行扩增，然后使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，筛选具有多态性的微卫星标记。在本研究中，共设计了400对微卫星引物，共成功筛选了73对微卫星引物。73对引物中，平均等位基因位点数为5.82（2-12），平均观测杂合度为0.602（0.258-0.909），平均期望杂合度为0.771（0.503-0.918），平均多态位点含量为0.686（0.372-0.890）。73个微卫星位点中，不到三分之一（22个）的位点表现为偏离哈迪温伯格平衡（p<0.05），12个微卫星位点为中度多态性（0.25<PIC<0.5），其余位点均为高度多态性（PIC>0.50）。微卫星的多态性与微卫星序列在基因组中存在的位置及微卫星重复单元长度有关。存在于内部的微卫星一般多态性较低，而远离编码区的微卫星序列具有较高的多态性；随着微卫星重复单元长度的增加，微卫星标记的多态性有下降的趋势。3.对大黄鱼群体遗传多样性及变异的分析本研究利用扩增效果好的20个微卫星标记对来自不同海域的5个大黄鱼群体进行了遗传多样性分析，结果表明：在5个群体中有3个自然群体（FYS、ZYS及HYS）以及2个养殖群体(FYZ和ZYZ)中，共扩增得到461个等位基因位点，海南自然群体具有最高的平均观测杂合度（Ho）、最高的平均期望杂合度（He）以及最高的多态性（PIC），分别是0.610、0.837和0.802，而在舟山自然群体具有最高的平均等位基因位点（Na），为9.000，除个别位点表现为中度多态性外（0.25＜PIC＜0.50），大部分位点表现为高度多态性（PIC>0.50）。5个群体中，3个自然大黄鱼的Ho（0.528）、He(0.827)及PIC(0.790)都高于2个养殖群体的Ho(0.472)、He(0.802)及PIC(0.762)，说明养殖大黄鱼的遗传多样性现状堪忧。5个群体之间的遗传距离为0.100-0.132，平均遗传距离为0.111，说明各群体间产生了一定程度的分化，其中，海南自然群体和福建自然群体之间的遗传距离最大，它们间的遗传分化系数也达到0.151。浙江自然群体与海南、福建自然群体也有一定程度的分化，支持徐恭昭等人对我国大黄鱼3个种群的划分。养殖与自然群体也出现了较大程度的分化，说明多年的累代养殖已造成大黄鱼种质的变化。根据遗传距离，使用Mega3.0建立5个群体之间的UPGMA聚类分析图，5个大黄鱼群体中由于浙江养殖群体与福建养殖群体遗传距离相对较近首先聚在一起，而后先后再与舟山自然群体，福建自然群体及海南自然群体聚在一起。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-16
第一章文献综述  16-26
  1.1 鱼类遗传多样性的研究方法  16-19
    1.1.1 形态学水平的研究  16
    1.1.2 染色体及其组型研究  16-17
    1.1.3 生化遗传学  17
    1.1.4 分子标记  17-19
  1.2 微卫星分子标记概述及其在遗传多样性研究中的应用  19-26
    1.2.1 微卫星 DNA 的发现  19-20
    1.2.2 微卫星 DNA 的分布  20
    1.2.3 微卫星的产生以及突变机理  20-21
    1.2.4 微卫星的功能  21-22
    1.2.5 微卫星的检测方法  22-23
    1.2.6 微卫星序列的获取  23-24
    1.2.7 微卫星标记在鱼类遗传多样性中应用  24-25
    1.2.8 本研究的内容、目的及意义  25-26
第二章基于基因组信息的大黄鱼（Pseudosciaena crocea）微卫星重复序列特征分析  26-36
  2.1 材料与方法  26-27
    2.1.1 基因组测序和全基因组信息获取  26-27
    2.1.2 微卫星序列获得  27
    2.1.3 全基因组微卫星序列的特征分析  27
  2.2 实验结果  27-33
    2.2.1 对大黄鱼基因组微卫星序列各重复类型的分析  27
    2.2.2 大黄鱼基因组微卫星各优势重复单元的碱基组成  27-28
    2.2.3 大黄鱼基因组微卫星长度及变异分析  28-32
    2.2.4 大黄鱼基因组微卫星中 AT 含量与不同重复单元微卫星的序列总数、累积长度以及平均拷贝数之间的相关性分析  32-33
  2.3 讨论  33-36
    2.3.1 大黄鱼全基因组微卫星各优势重复单元的碱基组成  33-34
    2.3.2 不同重复单元微卫星的长度与拷贝数以及变异系数之间的关系  34
    2.3.3 大黄鱼基因组微卫星中 AT 含量的分析  34-36
第三章基于基因组信息的大黄鱼（Pseudosciaena crocea）微卫星标记引物的快速筛选与评价  36-53
  3.1 实验材料  36-39
    3.1.1 实验材料  36
    3.1.2 实验仪器和试剂  36-37
    3.1.3 实验试剂  37-39
  3.2 实验方法  39-44
    3.2.1 大黄鱼微卫星基因组 DNA 的提取  39-40
    3.2.2 大黄鱼微卫星引物的设计  40-42
    3.2.3 PCR 扩增  42
    3.2.4 聚丙烯胶凝胶电泳检测 PCR 产物  42-43
    3.2.5 实验数据处理  43-44
  3.3 实验结果与分析  44-50
    3.3.1 琼脂糖凝胶电泳结果  44
    3.3.2 大黄鱼微卫星扩增和电泳结果  44-45
    3.3.3 大黄鱼微卫星多态性分析  45-50
  3.4 讨论  50-53
    3.4.1 基于全基因组微卫星标记开发的高效性分析  50
    3.4.2 大黄鱼自然群体微卫星多态性特征  50-52
    3.4.3 大黄鱼微卫星中影子带的探讨  52-53
第四章微卫星标记在大黄鱼（Pseudosciaena crocea）群体遗传中的应用  53-64
  4.1 实验材料  54
    4.1.1 实验材料  54
    4.1.2 实验仪器与试剂  54
  4.2 实验方法  54-56
    4.2.1 基因组 DNA 的提取  54
    4.2.2 PCR 扩增  54-56
    4.2.3 聚丙烯胶凝胶电泳检测 PCR 产物  56
    4.2.4 实验数据处理  56
  4.3 实验结果  56-61
    4.3.1 琼脂糖电泳检测大黄鱼基因组 DNA 结果  56
    4.3.2 聚丙烯凝胶电泳检测不同群体大黄鱼微卫星标记的结果  56-57
    4.3.3 大黄鱼群体遗传多样性  57-60
    4.3.4 大黄鱼群体之间的遗传距离和聚类分析  60-61
  4.4 讨论  61-64
    4.4.1 群体之间遗传多样性分析  61-62
    4.4.2 大黄鱼群体遗传分化的探讨  62-64
结论  64-66
参考文献  66-76
致谢  76-77
在读期间发表的学术论文及研究成果  77

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