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东方蜜蜂抗螨相关基因的筛选及初步验证

作　者: 殷玲
导　师: 陈国宏
学　校: 扬州大学
专　业: 特种经济动物饲养
关键词: 东方蜜蜂 狄斯瓦螨 转录组 蛋白质组 差异表达
分类号: S895
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


狄斯瓦螨(Varroa destructor)是对蜜蜂威胁最大的病虫害,几乎对全世界范围内的养蜂业都造成了巨大的损失。本研究基于课题组前期研究所获得的宝贵的蜂螨敏感型群体,采用Illumina Solexa测序技术及iTRAQ技术初步筛选出蜂螨抗性相关的候选基因,通过荧光定量PCR技术验证候选差异基因,并对相关基因编码区序列测定分析。本研究为进一步研究蜜蜂抗螨分子机理奠定基础,同时筛选出来的差异基因可为蜜蜂抗螨育种研究提供基因资源。主要研究结果如下：1.本研究选择狄斯瓦螨感染的西方蜜蜂巢脾对抗性群体及敏感性东方蜜蜂群体进行胁迫,采用以下措施降低各群体间的遗传背景：a)受蜂螨胁迫的抗性群体(C+)和受胁迫的敏感性群体(M+)所接受的西方蜜蜂巢脾受狄斯瓦螨蜂螨感染程度相当且具有数量相当的工蜂和雄蜂的封盖蜂房；抗性对照组(C)及敏感性对照组(M)使用未受瓦螨感染的西方蜜蜂巢脾。b)采用10对微卫星引物选择全同胞姐妹用于下一步实验。c)对蜂群受瓦螨胁迫的情况进行连续观察,发现敏感性群体抗螨能力较差,而抗性群体则在遭到蜂螨胁迫后24h时抗螨行为达到高峰,因此确定胁迫24h后进行样本采集。2.采用Illumina Solexa转录组测序技术对蜂螨胁迫及未遭蜂螨胁迫的敏感性和抗性东方蜜蜂群体进行哺育蜂头部转录组测序,从头组装获得了91,172个unigenes,对这些unigenes进行功能注释。COG分类中,共有23,790条unigene归类到25类基因功能。GO分类注释了85,577条unigene的生物学途径,其中参与细胞生理过程(14,797)和代谢过程(10,17)的最多；注释了48,194条unigene的细胞学组件,其中细胞及细胞组分最多,都为10,323条；描述了29,301条unigene的分子功能,其中结合功能(11,370)和催化活性(11,042)的最多。39,625条在KEGG数据库中注释到257条通路,定位到代谢通路的unigene数量最多(4793)。3.C+VS M+共产生了40,255条差异unigene,其中19,702条在C+下调表达,20,553条在C+上调表达。GO显著富集分析表明蜂螨抗性及敏感性东方蜜蜂在受到蜂螨胁迫时体内发生了不同的应答反应,而这些应答反应很可能伴随转录因子的变化。多条显著富集的pathway涉及病菌感染及抗菌物质的生物合成,说明敏感性蜂群和抗性蜂群对病菌的抵抗力存在差异。C VS M共有21,252条差异unigene,其中962条在C下调表达,20,290条在C上调表达。GO显著富集分析说明东方蜜蜂蜂螨抗性群体和敏感群体间存在免疫反应、肌肉发育、学习和记忆方面的差异。有71个DEGs被富集到了嗅觉转导通路中,说明可能两个群体间的嗅觉系统存在差异。C+VS C共有36,691条差异unigene,其中17,799条在C+下调表达,18,892条在C+上调表达。GO显著富集分析表明在蜂螨胁迫的情况下,东方蜜蜂产生了一定的应答反应,伴随的可能为转录因子的表达差异。多条显著富集的pathway涉及病菌感染及抗菌物质的生物合成,说明抗性群体在受到蜂螨胁迫时也同时受到了细菌的感染,同时通过自身免疫积极抵抗细菌。M+VS M共有24,508条差异unigene,其中21,479条在M+下调表达,3029条在M+上调表达。GO显著富集分析说明蜂螨敏感性蜂群在受到蜂螨胁迫时,其嗅觉功能发生了变化,可能形成了短期记忆,并伴随转录因子的表达差异。多条显著富集的pathway涉及细菌及病毒感染,只有O聚糖生物合成(0.49%)与免疫相关,说明敏感性群体对于细菌病毒的抵抗力低于抗性群体。4. Venn分析关注到的差异基因中,在C+中呈现极高表达的DEGss (Log2Ratio≥15)上调的270个,下调的8个,结合所有差异基因的GO及pathway显著富集分析结果进行进一步的分析,发现以下基因与抗螨相关：气味结合蛋白、肌钙蛋白、钙离子运输ATPase、转录因子、免疫相关基因、表皮蛋白、突触蛋白。5.以东方蜜蜂转录组数据作为参考序列,对四样本哺育蜂头部蛋白质进行iTRAQ定量分析,共鉴定到1532个蛋白质。GO分析显示与细胞组分相关的表达蛋白最多的是细胞和细胞组分相关蛋白,共占61.02%。结合功能包含的蛋白数量最多(45.30%)。大部分蛋白参与到基本的生物学过程,如细胞进程(20.01%)及代谢进程(19.68%)。pathway分析发现共有1503条蛋白注释到239个通路中,注释到新陈代谢通路的蛋白最多,这与转录组数据一致。6. C+VSM+共产生了72个差异蛋白,其中31个在C+下调表达,41个在C+上调表达。GO显著富集分析说明蜂螨抗性及敏感性东方蜜蜂在受到蜂螨胁迫时体内发生了不同的应答反应,这与转录组数据也是相符合的。差异蛋白显著富集的pathway为鞘脂类代谢。C VS M共有154个差异蛋白,其中82个在C下调表达,72个在C上调表达。GO显著富集分析说明蜂螨抗性东方蜜蜂和蜂螨敏感性东方蜜蜂的生命活力存在差异。差异蛋白显著富集于17个pathway,最为显著的是代谢途径。C+VS C共有202个差异蛋白,其中81个在C+下调表达,121个在C+上调表达。GO显著富集分析说明东方蜜蜂在受到蜂螨胁迫时体内发生了一系列的代谢产能反应及应答反应。差异蛋白显著富集于14个pathway,最为显著的为震颤性麻痹病。M+VS M共有161条差异unigene,其中94个在M+下调表达,67个在M+上调表达。GO显著富集分析说明蜂螨敏感性东方蜜蜂在受到蜂螨胁迫时,其生命活动受到了影响,并且体内发生了一定的应答反应。差异表达蛋白显著富集于25个pathway,最为显著的为震颤性麻痹病。7.韦恩分析及与转录组关联分析显示endocuticle structural glycoprotein SgAbd-2-like及obp13与抗螨相关。8.将基于参考基因得到的蛋白质鉴定结果和转录组结果进行关联,C VSM组中关联性(r)为0.3269；rM+VS M为0.0066；C+VS M+为0.0737；C+VS C为0.0774。结果表明两者间相关性较低。9.对嗅觉通路中的3个差异基因及其它与抗螨性状相关的差异基因共15个DEGss进行了qRT-PCR验证,结果显示其表达规律与转录组数据一致,说明转录组测序结果是可靠的。对obp17, obp18及mklb-1编码区进行了克隆测序,获得的obp17,obp18及mklb-1编码区序列长度分别为408bp,399bp,4887bp。将东方蜜蜂obp4, obp17, obpl8及mklb-1的氨基酸序列进行生物信息学分析,结果表明东方蜜蜂四个蛋白与西方蜜蜂高度同源,Obps都有信号肽,mklb-1没有信号肽,四个蛋白都没有跨膜区,都属于α型蛋白。

全文目录


中文摘要  3-6
Abstract  6-14
第一章 文献综述  14-34
  1 狄斯瓦螨的概述  14-17
    1.1 狄斯瓦螨的简介  14-15
    1.2 狄斯瓦螨的防治及存在的问题  15-17
      1.2.1 物理防治法  15-16
      1.2.2 化学防治法  16
      1.2.3 饲养管理防治法  16
      1.2.4 抗螨蜂种的培育  16-17
  2 蜜蜂抗螨的机制  17-25
    2.1 行为机制  17-19
      2.1.1 梳理行为机制  17-18
      2.1.2 卫生行为机制  18-19
      2.1.3 其它行为机制  19
    2.2 生理机制  19-21
      2.2.1 蜜蜂的封盖期  19
      2.2.2 蜜蜂幼虫对瓦螨的吸引力  19-20
      2.2.3 蜂群对蜂螨的繁殖力的影响  20-21
    2.3 分子机制的研究进展  21-25
      2.3.1 卫生行为的分子机制  21-23
      2.3.2 梳理行为分子机制  23-24
      2.3.3 蜂螨繁殖抑制分子机制  24-25
  3 转录组学研究方法及其在蜜蜂分子生物学中的研究进展  25-29
    3.1 转录组学研究方法  25-27
    3.2 转录组学在蜜蜂分子生物学中的研究进展  27-29
  4 蛋白质组学研究方法及其在蜜蜂分子生物学中的研究进展  29-32
    4.1 蛋白质组学研究方法  29-30
    4.2 蛋白质组学在蜜蜂分子生物学中的研究进展  30-32
  5 本研究的目的和意义  32-34
第二章 实验蜂群的构建  34-43
  1 材料和方法  34-38
    1.1 实验蜂群的组织  34-35
    1.2 实验蜂群的蜂螨胁迫  35
    1.3 全同胞姐妹鉴定  35-37
    1.4 试剂  37
    1.5 主要仪器设备  37
    1.6 基因组DNA提取  37-38
    1.7 微卫星引物合成PCR扩增检测  38
  2 结果与分析  38-41
    2.1 东方蜜蜂受蜂螨胁迫情况  38-39
    2.2 全同胞姐妹鉴定  39-41
  3 讨论  41-43
    3.1 实验蜂群的选择  41
    3.2 人工感染蜂螨的方式及时间  41-42
    3.3 全同胞姐妹的鉴定  42-43
第三章 东方蜜蜂头部组织转录组测序及抗螨相关基因的筛选  43-76
  1 材料和方法  43-49
    1.1 实验材料  43
    1.2 主要试剂  43-44
    1.3 主要仪器设备  44
    1.4 总RNA提取及检测  44
    1.5 转录组测序实验过程  44-45
    1.6 数据分析流程  45-49
      1.6.1 产量统计  46
      1.6.2 unigene的组装  46-47
      1.6.3 unigene的功能注释  47-48
      1.6.4 差异表达基因分析  48
      1.6.5 差异表达基因的GO和pathway分析  48-49
  2 结果与分析  49-70
    2.1 RNA提取及质量检测  50
    2.2 产量统计  50-51
    2.3 组装结果  51-55
    2.4 All-unigene的功能注释  55-58
      2.4.1 数据库比对结果  55-56
      2.4.2 unigenes的COG功能注释  56-57
      2.4.3 unigenes的GO功能注释  57-58
      2.4.4 unigenes KEGG代谢通路分析  58
    2.5 差异表达基因(DEGs)分析  58-68
      2.5.1 差异表达基因筛选  58-60
        2.5.1.1 C~+ VS M~+  59
        2.5.1.2 C VS M  59
        2.5.1.3 C~+ VS C  59
        2.5.1.4 M~+ VS M  59-60
      2.5.2 差异表达基因GO分析  60-61
      2.5.3 差异表达基因GO功能显著性富集分析  61-66
      2.5.4 差异表达基因pathway富集分析  66-68
    2.6 抗螨相关的基因分析  68-70
      2.6.1 四组差异基因间的韦恩分析  68-69
      2.6.2 抗螨相关的DEGss的分析  69-70
  3 讨论  70-76
    3.1 东方蜜蜂转录组测序数据库  70-71
    3.2 差异表达基因与抗螨性状相关  71-73
    3.3 抗螨候选基因分析  73-76
第四章 东方蜜蜂头部组织的蛋白质组学分析及抗螨相关蛋白质的筛选  76-114
  1 材料和方法  76-80
    1.1 实验材料  76
    1.2 试剂  76-77
    1.3 主要仪器设备  77
    1.4 蛋白提取及检测  77
    1.5 iTRAQ实验过程  77-79
      1.5.1 蛋白质浓度定量(Bradford定量)  77-78
      1.5.2 SDS电泳  78
      1.5.3 蛋白质酶解  78
      1.5.4 iTRAQ标记  78
      1.5.5 SCX分离  78
      1.5.6 基于Triple TOF 5600的LC-ESI-MS/MS分析  78-79
    1.6 数据分析流程  79-80
  2 结果与分析  80-110
    2.1 蛋白质检测  80-82
    2.2 蛋白质鉴定  82-86
      2.2.1 肽段鉴定质量评估  82-84
      2.2.2 蛋白质鉴定  84-86
    2.3 蛋白质功能注释  86-89
      2.3.1 GO功能注释  86-87
      2.3.2 COG功能分类  87-88
      2.3.3 pathway代谢通路注释  88-89
    2.4 差异表达蛋白质分析  89-107
      2.4.1 差异表达蛋白的鉴定  89-90
      2.4.2 差异表达蛋白的GO富集分析  90-103
      2.4.3 差异表达蛋白的pathway富集分析  103-105
      2.4.4 差异表达蛋白的韦恩分析  105-107
    2.5 蛋白质组与转录组的关联分析  107-110
      2.5.1 蛋白组与转录组结果关联  107
      2.5.2 差异蛋白与转录组差异基因的相关性分析  107-108
      2.5.3 差异蛋白与转录组差异基因表达模式的关联聚类分析  108-110
  3 讨论  110-114
    3.1 蜂螨胁迫东方蜜蜂头部差异表达蛋白质  110-112
    3.2 蛋白质组与转录组的关联分析  112-114
第五章 抗螨相关基因的初步验证  114-143
  1 材料和方法  114-118
    1.1 实验材料  114
    1.2 主要试剂及使用仪器  114-115
    1.3 试验方法  115-118
      1.3.1 蜜蜂头部总RNA提取、检测及反转录  115
      1.3.2 实时定量PCR引物设计及目的片段扩增  115-116
      1.3.3 CDs的克隆测序  116-117
      1.3.4 序列分析  117-118
  2 结果和分析  118-140
    2.1 差异基因的qRT-PCR验证  118-121
    2.2 Obp17,Obp18及Mklb-1编码区克隆测序  121-122
    2.3 Obp17,Obp18,Obp4及Mklb-1生物信息学分析  122-140
      2.3.1 Obp17的生物信息学分析  122-127
      2.3.2 Obp18的生物信息学分析  127-131
      2.3.3 Obp4的生物信息学分析  131-135
      2.3.4 Mblk-1的生物信息学分析  135-140
  3 讨论  140-143
全文结论  143-144
全文创新点  144-145
参考文献  145-165
附录  165-174
致谢  174-175
攻读学位期间发表学术论文(第一作者)  175-176

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