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展示在XL1-Blue大肠杆菌表面的链球菌GapC1-150aa免疫原性研究

作　者: 杨汐静
导　师: 崔玉东
学　校: 黑龙江八一农垦大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 奶牛乳房炎 链球菌GapC蛋白 大肠杆菌表面展示 免疫保护
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要


奶牛乳房炎是引起奶业重大经济损失的最常见疾病之一。该病主要由无乳链球菌、停乳链球菌、乳房链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等引起。随着耐药菌株不断出现和对奶中残留药物的限制，迫切需要研究能够同时预防多种病原菌感染的奶牛乳房炎疫苗。以往研究表明，链球菌表面GapC蛋白具有良好的免疫原性，能够预防奶牛乳房炎3种链球菌感染，并且GapC1-150aa具有与GapC全蛋白相近的免疫保护作用。本研究拟利用Red重组技术在大肠杆菌XL1-blue株表面展示GapC1-150aa蛋白，并研究其表面GapC1-150aa的免疫原性。为进一步研究用引起奶牛乳房炎的大肠杆菌展示链球菌抗原疫苗提供参考。本研究通过Red重组技术以构建的融合基因lpp’ompA-gapC1-150aa替换ompA基因，实现GapC1-150aa在大肠杆菌表面展示。根据已发表的停乳链球菌gapC、大肠杆菌ompA和lpp、质粒pKD3中cm基因序列设计引物，并通过重叠延伸PCR技术分别构建lpp’ompA-gapC1-150aa-cm和lpp’ompA-cm基因打靶片段，经电击转化将打靶片段导入含有质粒pKD46的大肠杆菌XL1-Blue中，构建重组菌株XL1-Blue/LOG76和对照菌株XL1-Blue/LO11。通过PCR扩增、基因测序、Western-blotting、全菌体ELISA、流式细胞术和激光共焦显微镜观察等方法检测和定位GapC1-150aa表达，结果证实GapC1-150aa借助Lpp’OmpA正确展示在大肠杆菌XL1-Blue表面，且构建菌株培养的生长情况无明显改变。将XL1-Blue/LOG76、XL1-Blue/LO11和GapC1-150aa蛋白用弗氏佐剂乳化后，分别接种ICR小鼠，并采取血清检测GapC1-150aa特异性抗体水平和抗体亚类，用ELISPOT检测IL-4和IFN-γ、间接ELISA方法检测IL-17A；然后分别用乳房链球菌、停乳链球菌和无乳链球菌菌株对免疫小鼠攻毒。结果，XL1-Blue/LOG76和GapC1-150aa均能够刺激产生高水平的特异性抗体；XL1-Blue/LOG76和GapC1-150aa组均能产生高水平的IL-4、IFN-γ、IL-17A与对照组相比差异显著；攻毒结果：S.uberis SD0306株攻毒，XL1-Blue/LOG76组的存活率为33%、XL1-Blue/LO11组存活率为17%，GapC1-150aa组存活率为67%、PBS组存活率为8%；S.dysgalactiae LS0312株攻毒，XL1-Blue/LOG76组存活率为42%、XL1-Blue/LO11组和PBS组存活率均为17%，GapC1-150aa组存活率为67%；S.agalactiaeLS0310株攻毒, XL1-Blue/LOG76组存活率为42%、XL1-Blue/LO11组存活率均为8%，GapC1-150aa蛋白组的存活率为58%、PBS组小鼠全部死亡。结果表明，本实验构建的XL1-Blue/LOG76成功将链球菌GapC1-150aa展示在E. coli表面，且能给免疫小鼠提供一定抗链球菌感染的能力。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-11
英文缩略词表  11-12
第一章 文献综述  12-22
  1.1 引言  12
  1.2 奶牛乳房炎链球菌致病因子研究进展  12-14
  1.3 链球菌 GapC 蛋白的研究进展  14-16
  1.4 奶牛乳房炎链球菌的疫苗研究进展  16-17
    1.4.1 全菌体灭活疫苗  16
    1.4.2 荚膜多糖疫苗  16
    1.4.3 基因工程亚单位疫苗  16-17
  1.5 大肠杆菌表面展示系统研究进展  17-18
    1.5.1 基于外膜蛋白的展示系统  17
    1.5.2 基于细菌表面附属物的展示系统  17-18
    1.5.3 基于脂蛋白的展示系统  18
    1.5.4 基于毒力因子的展示系统  18
  1.6 大肠杆菌基因 RED 重组技术研究进展  18-21
  1.7 研究的目的与意义  21-22
第二章 表面展示链球菌 GapC1-150aa大肠杆菌的构建  22-42
  2.1 材料  22-24
    2.1.1 菌种、质粒及宿主  22
    2.1.2 主要试验用试剂  22-23
    2.1.3 主要仪器设备  23-24
  2.2 试验方法  24-34
    2.2.1 引物的设计与合成  24-26
    2.2.2 模板质粒 pKD3 和 pQE30/lpp‘ompA-gapC1 的制备  26
    2.2.3 打靶片段 H1-Lpp’ompA’gapC1-linker-cm-H2 制备  26-28
    2.2.4 对照菌株打靶片段 H1-Lpp’ompA -linker-cm-H2 制备  28-30
    2.2.5 Dpn I 处理打靶片段  30
    2.2.6 表达 RED 重组酶菌株的制备和同源重组  30-32
    2.2.7 重组菌株 Western-blotting 检测 GapC1-150蛋白表达  32
    2.2.8 重组大肠杆菌生长曲线的测定  32-33
    2.2.9 GapC1-150aa蛋白表面定位的鉴定  33-34
    2.2.10 实验数据处理  34
  2.3 结果  34-42
    2.3.1 基因打靶片段构建结果  34-36
    2.3.2 重组子的鉴定结果  36-38
    2.3.3 重组蛋白的 Western blot 检测结果  38
    2.3.4 全菌体 ELISA 检测结果  38-39
    2.3.5 流式细胞术检测结果  39
    2.3.6 间接免疫荧光观察结果  39-40
    2.3.7 重组菌的生长曲线结果  40-42
第三章 重组菌 GapC1-150aa免疫原性研究  42-52
  3.1 材料  42
    3.1.1 菌株和实验动物  42
    3.1.2 工具酶和化学试剂  42
    3.1.3 主要仪器  42
  3.2 方法  42-45
    3.2.1 免疫原的制备  42-43
    3.2.2 试验动物分组及免疫接种  43-44
    3.2.3 攻毒试验  44
    3.2.4 间接 ELISA 测定抗体水平、亚类  44
    3.2.5 细胞因子检测  44-45
  3.3 结果  45-52
    3.3.1 GapC1-150aa蛋白的纯化结果  45-46
    3.3.2 抗体水平检测结果  46-47
    3.3.3 抗体亚类检测结果  47-48
    3.3.4 细胞因子检测结果  48-50
    3.3.5 重组菌的免疫保护结果  50-52
第四章 讨论  52-56
第五章 结论  56-58
参考文献  58-62
附录  62-72
致谢  72-74
作者简历  74

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 牛
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